2.1.2观察指标与检测方法
2.1.3脾淋巴细胞的制备
小鼠脾淋巴细胞制备参照文献[7]，简言之。小鼠脱脊椎处死，无菌取其脾脏。将脾脏用玻璃片磨碎，过膜，于1200 rpm离心5分钟。弃去上清，沉淀加入红细胞裂解液(每个脾脏约1ml)，混匀，静置1分钟，加入PBS，离心。再加入PBS，过膜，离心。将所剩细胞洗涤1-2次后，用含10%FBS的RPMI-1640将细胞调至所需浓度。
2.1.4 CCK-8法测定T细胞抗原特异性反应
制备各组小鼠淋巴细胞，接种于96孔板(4×105个/孔)，同时加入II型胶原(200mg/ml)进行刺激，细胞于含5%CO2培养箱中培养24 h，CCK-8法测定淋巴细胞的增殖情况。
2.1.5 组织病理学检查
小鼠处死后，取其后肢，加入10%福尔马林进行固定，然后脱钙和进行石蜡包埋，切片(4mm厚度)，苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，H&E)染色后显微镜下观察。
2.1.6 ELISA法检测CIA小鼠胶原(CII)诱导淋巴细胞的细胞因子产生水平
制备各组小鼠淋巴细胞，4×106个/ml与CII胶原共培养48h，收集细胞培养上清，ELIS A法检测细胞因子IFN-g，IL-4，IL-10，IL-17A，TNF-a和IL-6产生水平，检测方法见试剂盒说明书。
2.1.7 流式细胞术检测
流式细胞术检测参照文献[8-9]，简言之。收集各组脾淋巴细胞，冼液冼2次，加入IgG抗体，封闭FcR，加入荧光标记抗小鼠CD4、CD8、B220、CD11b和Gr.1抗体，进行表面标志染色，流式细胞仪检测，Flowjo软件分析。对胞内细胞因子染色：各组小鼠淋巴结、脾淋巴细胞与PMA、Ionomycin以及BFA于5%CO2培养箱中共培养4h后，收集细胞，冼液冼2次，加入IgG抗体，封闭FcR，进行表面标志染色。完毕后，固定、穿膜，加入荧光标记的抗IL-17、IFN-g抗体，流式细胞仪检测分析。对于胞内特异转录因子Foxp3的检测，无需上述刺激，按胞内细胞因子染色检测。
2.2 脾淋巴细胞增殖功能及细胞毒性检测
2.2.1 MTT法检测咖啡酸乙酯的细胞毒性
小鼠脾脏淋巴细胞 (4×105个/孔) 接种于96孔板，加入不同浓度的咖啡酸乙酯，另设相应的溶剂对照及培养液本底对照，于37℃，5% CO2培养箱中作用48h每孔加入20 ml 5mg/ml的 MTT，继续培养4h，吸弃培养液，加入150 ml DMSO终止反应，于震荡器震荡10分钟，使甲肷结晶完全溶解，酶标仪570 nm波长测定吸光度OD值。
2.2.2 CCK-8法测定丝裂原诱导脾淋巴细胞增殖功能
小鼠脾脏淋巴细胞 (4×105个/孔) 接种于96孔板，加入不同浓度的咖啡酸乙酯，同时加入ConA (终浓度1mg/ml)或LPS (终浓度10mg/ml)，另设无刺激剂的本底对照。于37℃，5% CO2培养箱中作用48h，CCK-8法检测丝裂原诱导脾淋巴细胞增殖功能。
2.3 荧光定量PCR (q-PCR)检测
纯化CD4+T的淋巴细胞与1、3 mM的咖啡酸乙酯在anti-CD3(5mg/ml) +anti-CD28 Ab (1mg/ml)刺激下共培养16 h，抽提各组淋巴细胞，应用Trizol试剂盒提取总RNA，按Takara逆转录试剂盒说明书操作合成cDNA。尔后应用SYBR GreenI嵌合荧光法在实时定量PCR仪进行Th1细胞相关基因(IFN-g，T-bet，STAT1 和 STAT4 mRNA)表达检测，相关引物由上海生物工程有限公司合成公司合成。在PCR反应程序结束后，进入仪器自带软件的数据分析界面，设置β-actin为内参基因，仪器自动计算出各实验组基因表达差异倍数及标准差，即2-△△Ct±标准差值。特异基因引物系列如下：
IFN-g: (sense) 5'-ATGAACGCTACACACTGCATC-3';
(anti-sense) 5'- CCATCCTTTTGCCAGTTCCTC-3';
T-bet: (sense) 5'- CCAGGAAGTTTCATTTGGGAAGC-3';
(anti-sense) 5'-ACGTGTTTAGAAGCACTG-3';
STAT1: (sense) 5'- TCACAGTGGTTCGAGCTTCAG-3';
(anti-sense) 5'-CGAGACATCATAGGCAGCGTG-3';
STAT4: (sense) 5'- GCAGCCAACATGCCTATCCA -3';
(anti-sense) 5'- TGGCAGACACTTTGTGTTCCA -3';
β-actin: (sense) 5'-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3',
(anti-sense) 5'-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3'.
2.3 Th1体外诱导分化
Th1体外诱导分化参照文献[10]，采用免疫磁珠法分离CD4+T cell，CD4+T细胞接种在anti-CD3 mAb/anti-28 mAb包被的24孔培养板上，分别加入IL-12和anti-mIL-4，诱导CD4+T细胞向Th1细胞亚群方向分化。72h后，流式细胞术检测胞内IFN-g表达水平，检测方法同上。