万春平 左爱学 徐世奎 郑喜 祁燕 李小丝 李兆福 彭江云
(云南中医学院第一附属医院中心实验室 云南中医学院中药学院 云南省药检所 云南中医学院第一附属医院风湿科)
(本论文荣获“第四届兰茂论坛”优秀论文一等奖)
摘要 目的：研究咖啡酸乙酯抗类风湿关节炎的作用及通过Th1细胞介导抗胶原关节炎的作用机制，为民族药地胆草临床应用于类风湿关节炎和传承与创新奠定基础。方法：构建淋巴细胞增殖细胞模型和牛II型胶原诱导的DBA/1小鼠关节炎(collagen induced arthritis，CIA)模型，按临床评分平均分为CIA模型组、甲氨蝶呤阳性组和咖啡酸乙酯给药组，石蜡切片H&E染色检测CIA小鼠关节炎病理损伤程度;酶联免疫吸附法检测胶原诱导脾淋巴细胞细胞因子的产生水平;流式细胞术检测淋巴细胞表面标志、胞内Th1、Th17和Treg细胞表达水平。体外构建Th1细胞分化模型，流式细胞术检测咖啡酸乙酯对Th1细胞分化的影响。荧光定量PCR检测IFN-g产生相关通路的基因表达水平(IFN-g，T-bet，STAT1和STAT4)。
结果：咖啡酸乙酯浓度依赖性抑制丝裂原ConA和TCR诱导的T淋巴细胞增殖活性;咖啡酸乙酯口服给药能显著降低CIA小鼠胶原关节炎的临床评分，明显改善CIA小鼠局部关节炎的症状(P<0.05)，减少CD11b+Gr-1+中性粒细胞浸润和胶原诱导脾淋巴产生Th1细胞因子(IFN-g)产生水平，抑制CIA模型小鼠脾淋巴细胞胞内IFN-g的表达(P<0.05)。与体内实验结果一致，薯蓣皂苷干预显著抑制Th1细胞体外分化，下调IFN-g产生通路IFN-g，T-bet，STAT1和STAT4的mRNA表达水平。
结论：民族药地胆草免疫抑制成分咖啡酸乙酯具有显著的抗关节炎的作用，其作用机制与抑制Th1细胞分化及IFN-g产生通路有关，该研究为民族药地胆草临床应用于类风湿关节炎奠定基础。
结论：地胆草;咖啡酸乙酯;类风湿关节炎;胶原关节炎;辅助性Th1细胞;Interferon–g
地胆草，为菊科地胆草属植物地胆草Elephantopus scaber L.具有清热解毒，利尿消肿等功效，也是傣族、苗族、彝族等少数民族的常用药。临床主要用于感冒、急性扁桃体炎、咽喉炎、眼结膜炎、流行性乙型脑炎、慢性肾炎和关节炎等[1-2]。现代研究表明地胆草具有解热、保肝、抗菌、抗炎、抗肿瘤、酶抑制、心血管和胃肠道保护等广泛的药理活性[3]。前期我们从该植物中分离出15个化合物，并对其免疫活性进行筛选，首次发现咖啡酸乙酯具有显著的免疫抑制活性[4]。最新研究表明，咖啡酸乙酯亦具有抗炎作用[5]。这些结果提示，地胆草免疫抑制活性成分咖啡酸乙酯在自身免疫性疾病(如类风湿关节炎)具有潜在的治疗作用。
胶原诱导的DBA/1小鼠关节关节炎(CIA)是用于研究人类类风湿性关节炎(RA)最经典、成熟的实验动物模型，在发病机理、疾病症状和病理特征上与RA都具有共同点，在国际上广泛应用于治疗类风湿关节炎药效评价和作用机理的研究[6]。本研究进一步在胶原关节炎小鼠模型上，研究地胆草免疫抑制活性成分咖啡酸乙酯通过抑制Th1免疫反应而介导治疗类风湿关节炎的作用机理，为民族药地胆草临床应用于类风湿关节炎和传承与创新奠定理论基础。
1.实验材料
1.1动物 C57BL/6小鼠，雌性，7-8周龄，体重18g左右; DBA/1小鼠，雄性7-8周龄，体重20g左右，均购自成都达硕生物科技有限公司，合格证号SCXK(川) 2008-24;动物饲养在SPF级动物房，实验动物至少饲养1周后使用。温度(22±1)℃，湿度55%±5%，12h光暗循环。饲料和水均在消毒后由动物自由摄取。所有实验均严格按照实验动物有关条例进行。
1.2 主要药物与试剂
咖啡酸乙酯由云南中医学院中药学院左爱学博士提供，呈白色粉末，纯度99%;RPMI-1640培养基购自GibcoBRL公司 (life Technologies,Grandisland,NY,USA);胎牛血清(fetal bovine serum)购自Hyclone 公司 (Logan,Utah,USA) ;牛II型胶原、弗氏完全佐剂(CFA)均购自Sigma公司(St.Louis.MO，USA);IFN-g、IL-10，IL-6，IL-4， TNF-a细胞因子ELISA检测试剂盒购自BD PharMingen 公司(San Diego，CA，USA)，IL-17A ELISA检测试剂盒来自eBioscience公司(San Diego，CA，USA);其他试剂为国产分析纯。
1.3实验仪器
Veriti PCR扩增仪购自美国ABI公司：MX3000P核酸扩增荧光检测仪来自美国Aglient公司;离心机购自德国Thermo Scientific Heraeus;RM2235石蜡切片机、EG1150H+EG1130C组织包埋机、HI1210烘片机、DM2500正置显微镜和ASP300S全自动组织脱水机均购自德国莱卡仪器有限公司;3111二氧化碳培养箱购自美国Thermo-fisher;流式细胞仪购自美国BD公司。
2. 实验方法及评价
2.1 胶原关节炎小鼠的诱导、分组及给药
DBA/1小鼠胶原关节炎的诱导参照文献制备[6]，具体方法：牛II型胶原加入0.1M的醋酸，浓度10mg/ml，提前1天4℃冰箱溶解，胶原与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化，待雄性DBA/1小鼠麻醉后，于其尾根部进行致敏，每只50ml/只，3周后以相同剂量进行再次免疫攻击，肉眼观察小鼠四肢，对关节炎的严重程度进行0-4级评分，每组小鼠四肢评分总和除以小鼠只数，取平均值作为临床评分。[0-4级评分系统：0=正常;1=一个或多个趾关节红或红肿;2=踝关节以下中度红肿;3=包括膝关节在内的严重红肿;4=包括膝关节在内的完全红肿，关节变形、残废。每只小鼠最多评分为16分]。第0天即为攻击当天。
2.1.1实验分组及给药
攻击9天后，对发病小鼠评分，按照临床评分平均分为关节炎病理模型组，阳性药甲氨蝶呤(MTX)(2mg/kg)给药组，咖啡酸乙酯(50mg/kg)给药组。关节炎病理模型组、阳性药MTX给药组分别给予溶剂对照和MTX 2mg/kg，咖啡酸乙酯组灌胃给予咖啡酸乙酯50mg/kg。以上给药组均在攻击9天后分组后开始给药，1次/天。