蠲痹颗粒对胶原诱导性小鼠关节炎Th1/Th2/Th17细胞因子表达谱的影响*(2)

　　1.3主要仪器

　　离心机购自德国Thermo Scientific Heraeus;3111二氧化碳培养箱购自美国Thermo-fisher;RM2235石蜡切片机、EG1150H+EG1130C组织包埋机、HI1210烘片机、DM2500正置显微镜和ASP300S全自动组织脱水机均购自德国莱卡仪器有限公司;Epoch连续波长酶标仪购自美国Bio-Tek公司。

　　2. 实验方法及评价

　　2.1关节炎的诱导及病变评定

　　牛II型胶原加入0.1M的醋酸，浓度10mg/ml，提前4天4℃冰箱溶解，胶原与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化，待雄性DBA/1小鼠麻醉后，于其尾根部进行致敏，每只50ml/只，3周后以相同剂量进行再次免疫攻击，肉眼观察小鼠四肢，对关节炎的严重程度进行0-4级评分，每组小鼠四肢评分总和除以小鼠只数，取平均值作为临床评分。[0-4级评分系统：0=正常;1=一个或多个趾关节红或红肿;2=踝关节以下中度红肿;3=包括膝关节在内的严重红肿;4=包括膝关节在内的完全红肿，关节变形、残废。每只小鼠最多评分为16分]。第0天即为攻击当天。

　　2.2实验分组及给药

　　攻击1周后，模型小鼠开始出现关节红肿，按临床评分平均分为CIA模型组，阳性药MTX组，蠲痹颗粒组，每组10只。CIA模型组、阳性药MTX组分别给予溶剂对照和MTX 1mg/kg，蠲痹颗粒组口服给予蠲痹颗粒浸膏1.89g/kg(相当于生药2.16g/kg)。以上给药均在攻击1周后开始给药，1次/天。给药量按照实验动物与人用药量的换算公式计算得出。

　　2.3 指标检测

　　2.3.1 细胞制备

　　再次免疫20天后，脱脊椎处死小鼠，无菌取其脾脏，制备单细胞悬液，红细胞裂解液除红细胞，用含2%FBS的RPMI-1640冼两次，并将细胞调至所需浓度。

　　2.3.2增殖反应

　　脾淋巴细胞(5×105个/孔)接种于96孔板，同时加入10mg/ml胶原或培养液对照，37℃，5%CO2培养48h，培养结束前24h掺入0.25mCi 3H-thymidine，培养结束时，将培养板冻存于-20℃冰箱，测定掺入细胞的DNA的3H-thymidine，以cpm值代表细胞增殖。

　　2.3.3 组织病理学检查

　　小鼠处死后，取其后肢，去毛后于10%福尔马林进行固定，之后脱钙和进行石蜡包埋，切片(4mm厚度)，苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，H&E)染色后显微镜下观察。

　　2.3. 4 Th1/Th2/Th17细胞因子表达谱的检测

　　2.3.4.1 Th1/Th2/Th17细胞因子的诱导

　　各组小鼠脾淋巴细胞(5×106个/孔)接种于24孔板，同时加入10mg/ml胶原或培养液对照，37℃，5%CO2培养48h。离心收集培养上清(5000rpm，4℃，5min)，冻存于-20℃待测。

　　2.3.4.2 制备标准曲线

　　按试剂盒说明书操作步骤，依次准备和稀释小鼠Th1/ Th2/Th17 细胞因子标准品，混合小鼠Th1/ Th2/Th17 细胞因子捕获珠，并将试剂和受试样品加入适当的试管进行孵育和分析，根据获取的数据，用流式细胞仪BD FACSComp Software 软件进行分析,绘制标准曲线。

　　2.3.4.3 检测待测样品

　　按试剂盒说明书检测步骤操作，将收获的待检细胞培养上清液与小鼠Th1/ Th2/Th17细胞因子混合捕获珠加入适当的试管进行孵育，上流式细胞仪检测，结果用BD CBA Software (BD Bio-sciences Pharmigen) 软件进行分析,处理得出细胞因子(pg·mL - 1)

　　2.3.5统计学分析

　　所有实验数据均采用统计学方法处理。均值间差异比较采用t检验或单因素方差分析，数据统计均以平均值±标准差表示，以P<0.05为显著水平。数据统计分析采用SPSS17.0统计软件包。