万春平1 彭江云2 李兆福2 李小丝1 郑喜1 祁燕1 吴晶金2
（1云南中医学院第一附属医院中心实验室 2云南中医学院第一附属医院风湿科）
（本论文荣获“第三届兰茂论坛”优秀论文一等奖）
摘要 目的：研究温阳散寒除湿法（蠲痹颗粒）调控致病性Th17细胞/ 免疫抑制功能Treg之间平衡而介导治疗类风湿关节炎的作用机理，阐明扶阳学派及吴生元教授应用扶阳理论治疗类风湿关节炎临床优效的科学基础。方法：构建牛II型胶原诱导的DBA/1小鼠关节炎（collagen induced arthritis，CIA）模型，按临床评分平均分为CIA模型组，蠲痹颗粒醇提物组，关节炎临床评分法观察CIA小鼠关节炎发病严重程度；石蜡切片H＆E染色分别测定CIA小鼠足爪关节和关节炎病理损伤程度；流式细胞术检测胞内Th17、Treg细胞表达水平；荧光定量PCR法检测Th17细胞相关基因的表达。构建体外T细胞抗原受体（TCR）诱导T细胞体外活化模型，酶联免疫吸附法检测（ELISA）检测Th1、Th17 、IL-10及IL-6细胞因子产生水平；Western blot检测TCR信号诱导的纯化T细胞MAPK 信号通路（ERK、P38）磷酸化水平。
结果：蠲痹颗粒能显著降低CIA小鼠胶原关节炎的临床评分，明显改善CIA小鼠局部关节炎的症状（P＜0.05），减轻炎症细胞浸润，抑制CIA模型小鼠脾淋巴细胞胞内IL-17细胞因子和Th17细胞相关基因的表达，上调免疫抑制功能Treg的比例，从而维持Treg/Th17正常平衡。蠲痹颗粒醇提物体外给药显著抑制ConA和Anti-CD3诱导的T细胞增殖活性，显著降低Th1细胞因子（IFN-g）（P<0.01）、Th17细胞因子（IL-17A）（P<0.05）和促炎因子IL-6产生水平（P<0.05），上调IL-10的表达水平（P<0.05），抑制MAPK通路ERK 磷酸化水平；结论：温阳散寒除湿法可能通过调控Th17细胞/ Treg平衡和MAPK信号通路而介导治疗RA的作用， 这一作用机制可能为“温阳散寒除湿法治疗RA（寒湿痹阻）理论的现代生物学特征，该研究为扶阳学派及吴生元教授应用扶阳理论治疗RA临床提供科学基础，丰富和发展中医治疗痹证理论的科学内涵。
关键词：温阳散寒除湿法；蠲痹颗粒；类风湿关节炎；胶原关节炎；Th17细胞； 调节性T细胞；
温阳散寒除湿法（蠲痹颗粒）是云南省名老中医吴生元教授基于扶阳理论，总结出治疗类风湿关节炎有效治法，该方主要由附片、川芎、桂枝、五加皮等药味组成，具有温经散寒、祛风除湿、通络止痛之功，主治寒湿痹阻之类风湿关节炎。蠲痹颗粒的临床及实验研究显示：蠲痹颗粒能明显改善RA活动期（寒湿痹阻证）的临床症状，降低CRP、ESR、RF等指标，具有较好的临床疗效；实验研究亦表明，蠲痹颗粒具有抗炎和镇痛作用，对大鼠佐剂性关节炎（AA）和CIA小鼠胶原关节炎有显著抑制作用[1-3]。然而其治疗类风湿关节炎的作用机制尚未明确，因此有必要进一步深入研究。
最新研究表明，Treg、Th17细胞功能和分化过程具有共同之处却又相互对抗，其平衡失调影响着RA（Rheumatoid Arthritis，RA）发生与转归[4-6] ，本研究以Th17细胞/ Treg平衡为切入点，研究温阳散寒除湿法调控Th17细胞/ Treg平衡而介导治疗RA的作用机理，以期揭示 “温阳散寒除湿法治疗RA（寒湿痹阻）理论的现代生物学特征及内在规律。
1、材料与试剂
1.1 动物 BALB/c小鼠，雌性，7-8周龄，体重18g左右； DBA/1小鼠，雄性7-8周龄，体重20g左右，均购自成都达硕生物科技有限公司，合格证号SCXK(川) 2008-24；动物饲养在SPF级动物房，实验动物至少饲养1周后使用。温度（22±1）℃，湿度55%±5%，12h光暗循环。饲料和水均在消毒后由动物自由摄取。所有实验均严格按照实验动物有关条例进行。
1.2 药物
1.2.1 蠲痹颗粒浸膏醇提物的制备：称取289.4g蠲痹颗粒浸膏，用蒸馏水溶液溶解混匀，在搅拌下加入乙醇，使含醇量达到80%，静置12h，离心，倾出上清液，过滤，滤液减压回收乙醇，得蠲痹颗粒药材浸膏，将浸膏放入真空干燥箱进行真空干燥2天左右，收获固体浸膏，得蠲痹颗粒浸膏3.658g，折合原药材：1g醇提物相当于79.11g蠲痹颗粒浸膏。
1.2.2 试剂 牛II型胶原、弗氏完全佐剂（CFA）购自Sigma公司(St．Louis．MO，USA)； APC-小鼠IL-17A抗体（TC11-18H10）、FITC-小鼠IFN-γ抗体（XMG1.2）、PE-Cy7小鼠CD4抗体(RM4.5)、PE-小鼠Foxp3（MF23）抗体购自BD PharMingen 公司(San Diego，CA，USA)；IL-10、IL-6、IL-17A 和IFN-g细胞因子ELISA检测试剂盒购自BD PharMingen 公司(San Diego，CA，USA)RPMI-1640培养基购自GibcoBRL公司 (life Technologies，Grandisland，NY，USA)；其他试剂为国产分析纯。
1.3主要仪器
3111二氧化碳培养箱购自美国Thermo-fisher；流式细胞仪购自美国BD Biosciences。Megafugel1.0R离心机来自德国Thermo Scientific Heraeus）RM2235石蜡切片机（德国莱卡仪器有限公司）、EG1150H+EG1130C组织包埋机、HI1210烘片机、DM2500正置显微镜、ASP300S全自动组织脱水机均购置德国莱卡仪器有限公司。
2、实验方法及评价
2.1关节炎的诱导及病变评定
DBA/1小鼠胶原关节炎的诱导参照文献制备[3]，具体方法：牛II型胶原加入0.1M的醋酸，浓度10mg/ml，提前1天4℃冰箱溶解，胶原与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化，待雄性DBA/1小鼠麻醉后，于其尾根部进行致敏，每只50ml/只，3周后以相同剂量进行再次免疫攻击，肉眼观察小鼠四肢，对关节炎的严重程度进行0-4级评分，每组小鼠四肢评分总和除以小鼠只数，取平均值作为临床评分。[0-4级评分系统：0=正常；1=一个或多个趾关节红或红肿；2=踝关节以下中度红肿；3=包括膝关节在内的严重红肿；4=包括膝关节在内的完全红肿，关节变形、残废。每只小鼠最多评分为16分]。第0天即为攻击当天。
2.2实验分组及给药
攻击1周后，模型小鼠开始出现关节红肿，按临床评分平均分为CIA模型组，蠲痹颗粒醇提物组，每组10只。CIA模型组给予溶剂对照，蠲痹颗粒组口服给予蠲痹颗粒醇提物21mg/kg（相当于生药2.16g/kg）。以上给药均在攻击1周后开始给药，1次/天。给药量按照实验动物与人用药量的换算公式计算得出。
2.3 指标检测
2.3.1 细胞制备
再次免疫20天后，脱脊椎处死小鼠，无菌取其脾脏，制备单细胞悬液，红细胞裂解液除红细胞，用含2%FBS的RPMI-1640冼两次，并将细胞调至所需浓度。
2.3.2 组织病理学检测
小鼠处死后，取其后肢，去毛后于10%福尔马林进行固定，之后脱钙和进行石蜡包埋，切片（5mm厚度），苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，H&E）染色后显微镜下观察，出现滑膜炎、血管翳面伴随少量软骨侵蚀；2=中度改变，出现大面积软骨缺失、侵蚀的血管翳面以及伴随着单个核细胞和多形核细胞侵润的滑膜增生；3=严重的滑膜炎，关节和骨侵蚀；4=关节结构的完全破坏。