段荔 段姮妃 李兆福*
（本论文荣获“第五届兰茂论坛”优秀论文三等奖）
【摘要】目的：探讨吴生元教授经验方（益气养血方）对膝骨关节炎大鼠Wnt/β-catenin的影响，揭示其治疗骨关节炎的部分机制。方法：将45只大鼠随机分为益气养血方组、模型组、正常组，每组各15只，除正常组外，益气养血方及模型组采用改良Hulth法构建大鼠膝骨关节炎模型。益气养血方组予益气养血方3.78g/kg.d灌胃；模型组予生理盐水2.5ml.d灌胃；正常组不予任何药物。连续给药8周，取右膝关节股骨内髁、双膝胫骨平台软骨组织，行HE染色；应用免疫组化Western Blot检测软骨组织中β-catenin、WISP-1、BMP-2、BMP-4、MMP-1、MMP-13 mRNA的表达；采用tunel法检测大鼠软骨细胞凋亡。结果：与正常组相比，模型组有显著关节病理改变及破坏。与模型组比较，益气养血方组能改善软骨病理损伤，显著下调β-catenin、WISP-1、BMP-2、BMP-4的蛋白表达，抑制KOA模型大鼠软骨细胞凋亡，差异有显著性意义。结论：益气养血方可能通过调控Wnt/β-catenin信号通路，下调β-catenin、WISP-1、BMP-2、BMP-4的蛋白表达，干预大鼠软骨细胞凋亡以保护关节软骨，抑制软骨退变。
Study on mechanism of Yiqi Yangxue Decoction through regulating Wnt/β-catenin signaling pathway on Cartilage of osteoarthritis
( 1 Yunnan Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, Kunming 650021, China; 2 Yunnan University of Traditional Chinese Medicine, Kunming 650500, China )
Abstract:Objective: To evaluate the mechanism of Yiqi Yangxue Decoction (Experience of Prof.Wu Shengyuan) through regulating Wnt/β-catenin signaling pathway, To reveal part of its mechanism for treating osteoarthritis. Methods:All 45 SD rats were randomly divided into normal group, model group and Yiqi Yangxue Decoction group. Except normal group，the other groups used the improved Hulth method to construct the rat knee osteoarthritis model.The rats in Yiqi Yangxue Decoction group were giving Yiqi Yangxue Decoction 3.78g/kg.d intragastric administration；the model group were intragastric administration with 2.5ml.d saline, the normal group were giving no intragastric administration.After 8 weeks,we moved the articular cartilage of the medial femoral condyle of the right knee joint and the cartilage of the tibial plateau, used the HE staining, detected the expression of β-catenin、WISP-1、BMP-2、BMP-4、MMP-1、MMP-13 mRNA in cartilage tissues by immunohistochemical Western Blot, and Apoptosis of chondrocytes was detected by tunel method.Results: Compared with the model group, the Yiqi Yangxue Decoction can improve the pathological damage of cartilage,down-regulate β-catenin、WISP-1、BMP-2、BMP-4, inhibit the apoptosis of chondrocytes.Conclusion: Yiqi Yangxue Decoction down-regulate β-catenin、WISP-1、BMP-2、BMP-4 to regulating Wnt/β-catenin signaling pathway , inhibit the apoptosis of chondrocytes to protect articular cartilage and inhibit cartilage degeneration.
益气养血方由黄芪、党参、陈皮、炙升麻、柴胡、当归、桂枝、白芍、防风、川芎、淫羊藿等14味药组成，为吴生元教授经验方，是临床治疗骨关节炎的有效验方，具有温经养血，益气通络之功。前期研究表明[ ][ ]，该方能抑制软骨细胞凋亡，保护软骨基质，延缓软骨退变。本实验拟通过观察益气养血方对大鼠KOA软骨β-catenin、WISP-1、BMP-2、BMP-4、MMP-1、MMP-13 mRNA的影响及大鼠软骨细胞凋亡情况，探讨其部分相关作用机制。
1 资料与方法
1.1 实验动物 SPF级，SD雌性大鼠45只，体重质约160﹣180g，动物许可证号SCXK(川)2015-030。
1.2 试验药物 益气养血方是由补中益气汤合桂枝汤加减化裁而成，全方由黄芪、党参、陈皮等14味药组成。总重250g，由云南中医学院第一附属医院中药房提供。加水煎煮、水浴浓缩成分别含益气养血方生药浓度为0.378 g/ml（相当于人临床等效剂量的0.5倍）。复方金霉素软膏（昆明振华制药，批号：20150701）。
1.3实验试剂 SABC试剂盒、鼠抗鼠多克隆一抗、山羊抗鼠克隆二抗、TUNEL试剂盒、Hoechst染色试剂盒。
1.4 实验方法
1.4.1 分组方法 45只SD大鼠适应性饲养1周后，精确称重进行排序，按照随机数字表法进行随机分组，分为正常组、益气养血方组、模型组，每组各15只。
1.4.2 造模方法 除正常组外，其余两组采用改良Hulth法制备大鼠KOA模型。方法如下：10%水合氯醛腹腔麻醉后，将鼠在仰卧位固定，去右侧膝关节内侧，理发器备皮，碘伏消毒，用手术刀侧切约1cm切口，从髌韧带内侧进入关节腔，切断前交叉韧带、内侧副韧带，切除内侧半月板，抽屉试验阳性，关节复位后逐层缝合切口。复方金霉素软膏涂抹伤口预防感染，连续给药7天。
1.4.3 实验干预 参照人与大鼠的体表面积剂量换算方法（Meeh-Rubner公式），计算得出益气养血方组大鼠每100g体重灌胃益气养血方0. 378g（即3.78g/kg，相当于人0.5倍临床等效剂量。予含益气养血方生药浓度为0.378g/ml灌胃，2ml/(kg.d)；模型组则予生理盐水灌胃，2ml/(kg.d)，正常组不予任何药物。
1.5 观察指标及方法 连续给药8周后，10%水合氯醛腹腔麻醉，取右膝关节表面滑膜及胫骨平台软骨组织置于10%中性甲醛溶液中固定，10%EDTA脱钙，脱钙56天，至大头针可轻松刺入为至。常规脱水，石蜡包埋。按照以下方法检测对应指标。
1.5.1 HE染色
4μm厚度切片，常规用二甲苯脱蜡至水洗，伊红染液染色3min，自来水洗涤，各梯度酒精（从低到高浓度）脱水，中性树胶封片，在正置显微镜下观察记录软骨组织形态。
1.5.2 免疫组化检测Wnt/β-catenin通路相关蛋白的表达
切片常规脱蜡至水。3% H2O2室温10min后蒸馏水洗3次。微波热复修后滴加BSA封闭液室温20min。滴加一抗，37℃1h左右PBS洗2min×3次。滴加生物素化山羊抗鼠IgG，20-37℃ 20min，PBS洗2min×3次。滴加试剂SABC，20-37℃ 20min，PBS洗5min×4次。DAB显色，苏木素轻度复染。脱水，透明，封片，显微镜观察，计算阳性率。
1.5.3 TUNEL法检测软骨细胞凋亡
切片常规脱蜡至水，3%H2O2室温10min。加0.01mol/L TBS，1:200稀释蛋白酶K37℃消化15min，每张切片加入20µl TdT DIG-d-UTP 标记缓冲液的混合液（1:1:18）中，37℃标记2h。每切片加入封闭液50µl，室温下静置30min，甩掉封闭液。将生物素化抗地高辛抗体用抗体稀释液稀释至1:100，混匀后每切片加入50µl。置样于湿盒中，37℃反应30min。0.01mol/L TBS洗2min×3次。抗体稀释液1:100稀释SABC，混匀后加至切片。37℃反应30min。0.01mol/L TBS洗5min×4次。DAB显色，苏木素轻度复染。0.01mol/L TBS洗，蒸馏水洗。脱水，透明，封片，显微镜观察，计算软骨细胞凋亡指数。可见棕黄色染色的软骨细胞胞质为阳性细胞。阳性率计算：光镜下计数每张玻片10个400倍视野，阳性率=阳性细胞数/细胞总数×100％。
1.6 统计学方法 采用SPSS18.0统计软件包进行统计学分析，组间比较采用t检验或单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。