RP-HPLC法测定不同煎煮时间下藏药三果汤中槲皮素、鞣花酸、柯里拉京的含量变化(2)

　　1.2 仪器

　　DFY-600高速万能粉碎机、Agilent1200型高效液相色谱仪（VWD检测器）、分析天平、水浴锅（HH-6）。

　　1.3 方法

　　1.3.1 三果汤散的制备

　　将余甘子、诃子、毛诃子三味药材干果均去核后分别经高速万能粉碎机打粉，再过5号筛，备用。按《藏药标准》称取余甘子粉末12g、诃子粉15g、毛诃子粉10g各4份，分别混合均匀即得三果汤散，并置于4个烧杯中，备用。

　　1.3.2 三果汤供试品的制备

　　将4个烧杯中分别加入纯化水各约100ml，使料液比为1:3。将烧杯均置于垫有石棉网的电磁炉上加热（温度为140℃），待药液沸腾后，取下烧杯置于温度为80℃的恒温水浴锅中，进行煎煮，并按10min、20min、30min、40min的时间计时，煎煮时间完毕后，置于室温冷却并过滤，将滤液用0.45的微孔滤膜过滤即得HPLC的供试品。

　　1.3.3 槲皮素、鞣花酸、柯里拉京的标准品溶液制备

　　精密称取槲皮素标准品2.2mg，置于10ml的容量瓶中，加60%乙醇（分析醇）定容成0.22mg/mL的溶液，用0.45的微孔滤膜过滤即得HPLC的对照品，备用。精密称取鞣花酸标准品0.80mg，置于10ml的容量瓶中，加80%甲醇（分析醇）定容成0.08mg/mL的溶液，用0.45的微孔滤膜过滤即得HPLC的对照品，备用。精密称取柯里拉京标准品0.10mg，置于10mL的容量瓶中，加100%的甲醇（分析醇）定容成0.01mg/mL的溶液，用0.45的微孔滤膜过滤即得HPLC的对照品，备用。

　　1.3.4  槲皮素测定方法

　　1.3.4.1  槲皮素色谱条件

　　色谱柱为Agilent C18ZORBAX SB-C18柱（4.6×250 mm, 5 um）；流动相：甲醇-0.5%磷酸溶液（50:50），检测波长为370nm，柱温30℃。进样量10ul，流速为1.0ml/min。

　　1.3.4.2  槲皮素线性关系考察

　　精密称取对照品2.2 mg，用60 %的乙醇定容至10 mL容量瓶中，摇匀作为储备液。按上述槲皮素的色谱条件分别取1、3、5、7、9、11 uL不同体积进样，以槲皮素的峰面积（Y）对标准品的质量（X）进行线性回归，可得出线性方程Y=47491X+1.301，r=0.9992。结果表明：槲皮素峰面积值与质量有良好的线性关系，线性范围为0.22-2.42μg。（HPLC色谱图见图一）

　　1.3.5 鞣花酸、柯里拉京含量测定方法

　　1.3.5.1 鞣花酸、柯里拉京色谱条件

　　色谱柱为Agilent C18ZORBAX SB-C18柱（4.6×250 mm, 5 um）；流动相：

　　甲醇－0.1%磷酸溶液梯度洗脱：0-10min，5:95；10-15min，10:90；15-30min，15:85；30-50min，30:70；50-60min，40:60。检测波长为259nm；柱温：30℃；流速：1.0ml/min；进样量为10μl。

　　1.3.5.2  鞣花酸、柯里拉京线性关系考察

　　精密称取鞣花酸对照品0.80 mg，用80 %的甲醇定容至10 mL容量瓶中，摇匀作为储备液。精密称取柯里拉京对照品0.10 mg，用100 %的甲醇定容至10 mL容量瓶中，摇匀作为储备液，按上述鞣花酸、柯里拉京的色谱条件分别取1、3、5、7、9、11 uL不同体积进样，以鞣花酸、柯里拉京的峰面积（Y）对标准品的质量（X）进行线性回归，可得出二者的线性方程，分别为：Y = 19853X - 8.9757，r = 0.9999。：Y = 53331X + 710.37，r = 0.997。结果表明：鞣花酸、柯里拉京峰面积值与质量有良好的线性关系，线性范围分别为0.08-0.88μg和0.01-0.11μg。（HPLC色谱图见图二、三）