邢利威1,何喆1,孙玉环1,贺明1,余顺1,陈阳2,徐金龙3,梅瑞4,赵荣1✉
(1.云南中医药大学,云南昆明,650500;2. 海南省妇女儿童医学中心,海南海口,571100;3. 云南省妇幼保健院,云南昆明,650021;4. 云南省中西医结合医院,云南昆明,650224)
摘要：目的 比较常规激素替代周期与基于“冲为血海”的分期针灸联合激素替代对薄型子宫内膜反复移植失败患者焦虑状态、子宫内膜厚度及妊娠结局的影响及相关性分析。方法 将72例薄型子宫内膜反复移植失败患者随机分为对照组和分期针灸组各36例，对照组采用常规激素替代周期方案，分期针灸组在对照组基础上加用基于“冲为血海”的分期针灸疗法，主穴内关、公孙，根据女性月经分期取穴，1周3次，连续3个月经周期，比较两组治疗前后“着床窗口期”子宫内膜厚度、形态、汉密尔顿焦虑量表，治疗后临床妊娠率、活产率、周期取消率。结果 分期针灸组临床妊娠率、活产率高于对照组，周期取消率低于对照组；两组“着床窗口期”子宫内膜厚度、A和B型内膜比例较治疗前增加、汉密尔顿焦虑量表分数较治疗前减少（P<0.05），且分期针灸组疗效优于对照组（P<0.05）；薄型子宫内膜反复移植失败患者内膜厚度和焦虑水平呈负相关（P<0.05），临床妊娠及活产患者的内膜厚度比未妊娠患者显著增加，汉密尔顿焦虑评量表分数显著减少（P<0.05）。治疗过程中对照组4例患者有恶心、胃胀等不良反应，分期针灸组未出现不良反应。结论 薄型子宫内膜反复移植失败患者的焦虑状态与子宫内膜厚度呈负相关，“着床窗口期”汉密尔顿焦虑量表分数减少、内膜厚度增加可显著改善妊娠结局；在替代周期基础上，加用基于“冲为血海”的分期针灸能有效改善薄型子宫内膜反复移植失败患者的焦虑、子宫内膜厚度及类型，提高临床妊娠率及活产率，降低周期取消率，并减少药物不良反应。
关键词：针灸；反复移植失败；薄型内膜；子宫内膜容受性；焦虑
Effect of staging acupuncture based on "chong is the sea of blood" on anxiety and endometrial thickness of RIF patients with thin endometrium and its correlative study
XING Li-wei1, HE Zhe1, SUN Yu-huan1, HE Ming1, YU Shun1, CHEN Yang2, XU Jin-long3, MEI Rui4, ZHAO Rong1✉
(1.Yunnan University of Chinese Medicine, Kunming 650500, Yunnan Province, China; 2. Women and Children’s Medical Center, Haikou 571100, Hainan Province, China; 3. Yunnan Maternal and Child Health Hospital, Kunming 650021, Yunnan Province, China; 4. Yunnan Integrated Traditional Chinese and Western Medicine Hospital, Kunming 650224, Yunnan Province, China)
Abstract: Objective To compare the effects of hormone replacement cycle and staging acupuncture based on " Chong is the sea of blood " combined with hormone replacement on anxiety state, endometrial thickness and pregnancy outcome of patients with thin endometrial recurrent implantation failure (RIF) and analyze their correlation. Methods 72 thin endometrial recurrent implantation failure (RIF) patients were randomly divided into control and staging acupuncture group (36 cases in each group). Control group used hormone replacement cycle. The staged acupuncture group was combined with staging acupuncture based on " Chong is the sea of blood " on the basis of control group therapy. The main acupoints were Neiguan(PC 6) and Gongsun(SP 4). Corresponding acupuncture prescriptions were selected according to the menstrual stages of women. Acupuncture treatment 3 times a week for 3 consecutive menstrual cycles. Endometrial thickness, morphology, Hamilton anxiety scale, clinical pregnancy rate and live birth rate after implantation were compared between the two groups before and after implantation during the implantation window period. Results The clinical pregnancy rate and live birth rate of staged acupuncture group was higher than that of control group, and the cycle cancellation rate of staged acupuncture group was lower than that of control group. The endometrial thickness and the proportion of type A, B endometrial increased in the implantation window period, and the score of Hamilton Anxiety Scale decreased in the two groups compared with that before treatment (P<0.05), and the effect of staged acupuncture group was better than that of control group (P<0.05). There was a negative correlation between endometrial thickness and anxiety in patients with thin endometrial recurrent implantation failure (P<0.05). The endometrial thickness in patients with clinical pregnancy and live birth was significantly higher than that in patients with pregnancy failure, and the score of Hamilton anxiety Scale was significantly decreased (P<0.05). During the treatment, 4 patients in the control group had nausea, stomach distension and other adverse reactions, while no adverse reactions occurred in the staged acupuncture group. Conclusion There is a negative correlation between anxiety state and endometrial thickness in patients with thin endometrial recurrent implantation failure. The decrease of Hamilton anxiety Scale score and increase of endometrial thickness during the implantation window period can significantly improve pregnancy outcome. On the basis of conventional western medicine, the staging acupuncture based on " Chong is the sea of blood " can effectively relieve anxiety of patients with thin endometrial recurrent implantation failure., thus improving the endometrial thickness and type during the "implantation window period", ultimately improving the clinical pregnancy rate and live birth rate, and reducing adverse drug reactions.
Key words: acupuncture; recurrent implantation failure; thin endometrium; endometrial receptivity; anxiety
反复移植失败(recurrent implantation failure, RIF)指年龄小于40岁，经过至少３次新鲜或冻融胚胎移植，移植优质胚胎数不少于４枚而无临床妊娠的不孕女性[1]，其发生率高达10%-15%[2]，其中薄型子宫内膜比例高达30%[3]，薄型子宫内膜定义为黄体中期(月经第20-24天)子宫内膜厚度低于7mm，子宫内膜厚度是评价子宫内膜容受性的重要指标，与胚胎移植的妊娠结局紧密相关[4]。RIF不仅可引发卵巢过度刺激综合征、取卵后出血等多种并发症，还易导致由经济、家庭多方面压力引起的焦虑，而RIF焦虑可能会降低子宫内膜容受性，造成移植失败，形成恶性循环[5]。采用激素序贯疗法治疗薄型子宫内膜不良反应较大且复发率高[6]，针灸作为一种安全、有效的治疗方式已在辅助生殖领域广泛应用[7-8]，本研究通过观察基于“冲为血海”的分期针灸疗法对改善薄型子宫内膜反复移植失败患者焦虑状态、子宫内膜厚度及妊娠结局的影响，为针灸介入RIF身心治疗提供证据，现报告如下。
1.临床资料
1.1一般资料
招募2019年9月至2020年9月于云南省中医医院针灸科门诊、云南省第二人民医院生殖科就诊的薄型子宫内膜反复移植失败患者，根据样本含量估算公式：
，显著性水准α=0.05，检验效能1-β=0.9，单侧检验Zα=1.65，Zβ=1.28，根据前期预试验，对照组保持率P0=30%,分期针灸组保持率P1=86%,预计脱落率p=10%，经过计算单组样本量≈35.283，最后取36例为单组样本量，两组共72例。应用Resman数据库的随机数生成法实施分配和隐藏，按1：1比例将其随机分为分期针灸组和对照组,评估和统计人员均不知道分组情况。本研究已经云南省中医医院伦理委员会审批(伦理批号:2017032-01)，并于中国临床试验注册中心注册（注册号：ChiCTR1800017191）。
1.2诊断标准
①不孕症诊断标准[9]：排除男方原因，未采用避孕措施而1年未妊娠者；②反复移植失败诊断标准[1]：经过至少３次新鲜或冻融胚胎移植且移植优质胚胎数不少于４枚，而均无临床妊娠;③薄型子宫内膜诊断标准[4]：黄体中期（月经第20-24天）子宫内膜厚度＜7mm。
1.3纳入标准
①符合上述诊断标准，拟再进行胚胎移植者；②患者及其配偶年龄为24-40岁；③月经周期规律(27-35天),且自然周期有正常排卵；④月经周期第2-5天血清基础卵泡刺激素(FSH)≤15IU/L,双侧卵巢基础窦卵泡数≥6个；⑤仍有≥2枚优质冻存胚胎；⑥愿意接受本研究方案治疗措施，连续观察3个月经周期，并签署知情同意书。
1.4排除标准
①其他明确原因引起的反复移植失败者，如染色体异常；②合并有多囊卵巢综合症、子宫内膜异位症、子宫肌瘤、宫腔粘连等病变;③男方有严重的少、弱精子症；④合并有其他系统疾病史及有吸烟、饮酒等不良嗜好者;⑤过敏体质或对针灸过敏者。
2.治疗方法
2.1对照组
予常规激素替代周期方案。月经第3天起予戊酸雌二醇片（拜耳医药保健有限公司广州分公司，国药准字J20171038，1mg），每日早晚各1mg口服，于5—7d后复诊，行阴道超声监测子宫内膜厚度及形态，根据内膜生长情况酌情增加用药剂量，可增加到6—8mg/d，连续服用3个月经周期，待第3个月经周期第15-18天子宫内膜厚度≥7mm，血E2值＞200pg/ml时，予黄体酮注射液（浙江仙琚制药股份有限公司，国药准字H33020828，1ml:20mg），每日60mg肌肉注射，4天后行胚胎移植。若内膜不达标（3个月经周期第15-18天子宫内膜厚度<7mm）则取消本周期移植。
2.2分期针灸组
在对照组基础上加用分期针灸疗法。
选穴：①基于“冲为血海”的分期针灸疗法主穴选取公孙、内关；②根据女性生理周期的分期选穴：月经期取合谷、三阴交、肝俞；滤泡期取肓俞、子宫(灸)；排卵期取水道、归来，局部电针；黄体期取三阴交、至阳、肾俞(灸)。③根据患者辩证分型施治选穴：肾阳不足：月经期取肾俞，滤泡期取太溪、然谷（灸）、后溪，排卵期取足三里、太冲、头皮针生殖区（位于头部额角发际上2cm处），黄体期取命门、气海俞；痰瘀内阻：月经期取次髎，滤泡期取阴陵泉、中脘（灸）、中极，排卵期阴陵泉、合谷、头皮针生殖区，黄体期脾俞、肝俞、委阳；气血双虚：月经期取肾俞、次髎，滤泡期取三阴交、足三里，排卵期取足三里、三阴交、头皮针生殖区，黄体期取膈俞、列缺、照海。以上①+②+③即为本针法组成。
操作：患者月经期、黄体期取俯卧位，滤泡期、排卵期取仰卧位，75%乙醇酒精常规消毒，腹部、四肢部及腰背部穴位选用0.30 mm×40mm的一次性无菌针灸针，头部穴位选用0.30 mm×25mm的一次性无菌针灸针。腹部穴位舒张进针，针刺方向朝下腹部，针刺至皮下15-30mm，采用徐入徐出导气法，以针感放射至会阴为度；腰骶部穴位夹持进针，90°直刺至皮下25-40mm，得气后行捻转平补平泻法，以针感向会阴部放射为佳；头皮针生殖区提捏进针，15°平刺至皮下10-25mm，以得气且患者耐受为度；余穴采用平补平泻手法，以得气为度，每10 min行针1次，留针30min。温针灸：于相应皮肤的针身上夹垫2-3层纸片，取长1cm的艾条用镊子在其中央戳孔，燃后将燃烧面朝向针尖放置在针柄上行温针灸，每穴一壮，每次约30分钟。电针：连接G6805-Ⅱ型电针仪，选取连续波，2Hz/15Hz，电流强度0.1-1.0mA，以患者局部肌肉微颤为度，每次30分钟。1周3次，1个月经周期为1个疗程，共治疗3个疗程，针刺操作由具有执业医师资格的针灸专业医师进行。
3.疗效观察
3.1观察指标
（1）子宫内膜厚度及形态监测:于入组前及治疗后预备周期“着床窗口期”（月经周期第21天）行阴道B超检查，于子宫长轴切面，测量双层子宫内膜厚度；本研究选取Gonen[10]内膜分型法：A型：外层和中央层呈强回声状态，内层和宫腔中线呈低回声状态，子宫中线回声较强；B型:可见均一的回声强度，呈中等回声状态，宫腔中线呈无明显回声状态；C型：呈均质强回声的状态，无宫腔中线回声。A型及B型内膜有利于胚胎着床。
（2）汉密尔顿焦虑评量表（HAMA-SAS评分）[11]：用于反映患者的焦虑程度，含20项，用4级评分，准总分100分，50分为分界值，分值越高表明焦虑程度越严重，检测记录时间为患者入组前及治疗后预备周期“着床窗口期”（月经周期第21天）。
（3）妊娠结局观察:临床妊娠：患者移植后第5周经阴道B超检查，有胎心搏动、胎芽、胎囊；活产：通过电话随访，胎龄28周或体重达1000g的婴儿出生时具有生命现象（如呼吸、心跳、脐带搏动、随意肌缩动之一项）[12]。
（4）周期取消率：若内膜不达标（3个月经周期第15-18天子宫内膜厚度<7mm）则取消本周期移植，周期取消率= 周期取消例数/病例总数×100%。
3.2安全性评价
针灸医生应针对患者治疗中的安全性问题（如药物和针灸不良反应等）做出及时有效处理，并在《病例报告表》详细记录治疗细节（如药物剂量、干预程度等），必要时及时中止试验，评判不良事件与研究方案的相关性，讨论是否需要完善修改研究方案。
3.3统计学方法
采用SPSS26.0统计软件进行统计分析, 计量资料满足正态分布采用均数±标准差（±ｓ）表示，组内比较采用配对样本t检验，组间比较采用两独立样本t检验，不满足正态分布的采用Wilcoxon秩和检验，各指标之间的相关性采用Pearson相关性分析；计数资料用频数或百分率（%）表示，采用χ2检验，各指标之间的相关性采用Spearman相关性分析；计数资料与计量资料之间的相关性采用方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。
3.4结果
(1)两组患者一般资料比较
两组患者年龄、不孕年限、既往移植次数、内膜厚度及类型、HAMA-SAS评分等一般资料比较无统计学意义（P＞0.05），具有可比性，详见表1。
表1 两组患者一般资料比较（±S）
(2)两组患者治疗前后子宫内膜厚度及类型比较
治疗后“着床窗口期”两组患者子宫内膜厚度水平较治疗前增高(P<0.05)，且分期针灸组治疗后子宫内膜厚度显著高于对照组(P<0.05)；对照组治疗后“着床窗口期”A、B型内膜与治疗前相比无统计学意义（P>0.05）,分期针灸组治疗后A、B型内膜显著高于治疗前(P<0.05)，且较对照组相比具有统计学差异(P<0.05)，见表2。
表2 两组患者治疗前后子宫内膜厚度及类型比较
注:与本组治疗前相比，(1)P<0.05;与对照组治疗后比较，(2)P<0.05。
(3)两组患者治疗前后汉密尔顿焦虑评量表（HAMA-SAS评分）比较
治疗后“着床窗口期”两组患者HAMA-SAS评分较治疗前降低（P<0.05），分期针灸组治疗后“着床窗口期”子HAMA-SAS评分低于对照组(P<0.05)。详见表3。
表3 两组患者治疗前后HAMA-SAS评分比较
注:与本组治疗前相比，(1)P<0.05;与对照组治疗后比较，(2)P<0.05。
(4)两组患者妊娠结局比较
分期针灸组治疗后临床妊娠率、活产率显著高于对照组，(P<0.05)，见表4。
表4 两组患者妊娠结局比较
注:与对照组治疗后比较，(1)P<0.05。
(5)两组患者周期取消率比较
分期针灸组治疗后周期取消率显著低于对照组，(P<0.05)，见表5。
表5 两组患者周期取消率比较
注:与对照组治疗后比较，(1)P<0.05。
(6)薄型子宫内膜RIF患者妊娠结局、子宫内膜厚度、焦虑状态之间的相关性比较
比较治疗前后“着床窗口期”两组患者子宫内膜厚度与焦虑水平的关系：RIF薄型子宫内膜患者“着床窗口期”子宫内膜厚度和焦虑水平呈负相关（r<0），差异有统计学意义（P<0.05），见表6；比较不同妊娠结局与“着床窗口期”子宫内膜厚度的关系：活产、临床妊娠、未妊娠患者“着床窗口期”内膜厚度有统计学差异（P<0.05），且活产、临床妊娠患者“着床窗口期”内膜厚度显著高于未妊娠患者（P<0.05），见表7。比较不同妊娠结局与“着床窗口期”焦虑水平的关系：活产、临床妊娠、未妊娠患者“着床窗口期”汉密尔顿焦虑评量表（HAMA-SAS评分）有统计学差异（P<0.05），且活产、临床妊娠患者“着床窗口期”汉密尔顿焦虑评量表（HAMA-SAS评分）显著低于未妊娠患者（P<0.05），见表7。以上提示薄型子宫内膜反复移植失败患者的焦虑状态会影响“着床窗口期”子宫内膜厚度，两者呈负相关关系，而“着床窗口期”子宫内膜厚度及焦虑状态会影响妊娠结局。
表6 RIF薄型子宫内膜患者子宫内膜厚度和焦虑水平相关性
表7 RIF薄型子宫内膜患者妊娠结局和子宫内膜厚度相关性
注:与未妊娠患者相比，(1)P<0.05;(2)临床妊娠、活产、未妊娠3种不同结局相比，P<0.05。
（7）安全性评价
对照组有4例患者出现恶心、胃胀、头晕等不良反应，分期针灸组未出现不良反应。提示针灸疗法可有效减轻药物不良反应。
4.讨论
子宫内膜容受性是指子宫内膜允许胚胎黏附、侵入并诱导内膜间质变化以使胚胎植入的一种能力，子宫内膜仅在容受性最高的着床窗口期（月经第20-24天）允许胚胎植入，此期容受性下降是引起反复移植失败的重要原因[13]。子宫内膜厚度、形态是衡量容受性的重要指标，内膜厚度与妊娠率呈正相关[14]，A、B型子宫内膜的着床率明显高于C型[15]。随着医学模式由生物医学向生物－心理－社会模式转变，薄型子宫内膜反复移植失败患者的焦虑情绪逐渐被关注，研究表明，机体长期处于焦虑状态会引起神经递质介导的交感神经状态改变，从而影响子宫内膜发育，降低子宫内膜容受性[16]，Gonzalez等[17]研究表明焦虑情绪与薄型子宫内膜存在一定相关性。本研究发现薄型子宫内膜反复移植失败患者的焦虑状态显著影响“着床窗口期”子宫内膜厚度，两者呈负相关，“着床窗口期”汉密尔顿焦虑评量表分数减少、内膜厚度增加可显著改善妊娠结局，与前人研究一致。目前治疗薄型子宫内膜主要采用激素序贯疗法，但其存在血栓、子宫内膜病变等风险。相关研究认为针灸可调整下丘脑--垂体—卵巢轴，改善子宫内膜微环境，提高子宫内膜容受性，其分子机制可能与VEGF、EG-FR[18]相关。同时针灸可通过调节大鼠海马内nNOS的表达，从而改善焦虑状态[19]。本研究选取临床治疗经典方案—常规激素替代周期方案作为对照组，旨在进行针灸联合常规激素替代周期方案的增效研究，结果表明联合应用能有效改善薄型子宫内膜反复移植失败患者的焦虑情绪，从而改善“着床窗口期”子宫内膜厚度及类型，最终提高临床妊娠率及活产率，且疗效显著优于常规激素替代周期方案，并可减少药物不良反应，为针灸介入RIF身心治疗提供证据。
本病属中医“不孕”范畴，祖国医学认为，肾—天癸-冲任间的平和稳态是受孕的必要因素，恰与现代医学的下丘脑-垂体-卵巢不谋而合。基于“冲为血海”的分期针灸疗法，即以公孙、内关为主穴，两穴合用，通过调节胃心胸，激发“心主血脉”，疏通胸中气机，起到调整冲脉气血的作用。《血证论》云：“仲景治血以治冲为要”[20]，冲脉有“血海”、“五脏六腑之海”之称，与女性孕产功能密切相关，而冲脉无穴位，故选择与之相通的八脉交会穴——公孙为主穴，因其同为足太阴脾经络穴，可沟通脾胃两经之气，胃气和降，气血充盛，促进内膜生长[21]。内关为手厥阴心包经络穴，别走至手少阳三焦经，通于阴维脉，可维系诸阴，具有滋阴助孕，疏通经脉的作用，同时心包络乃血与阴聚集之处，《针灸甲乙经》中记载：“虚则烦心，心惕惕不能动，失智，内关主之。心憺憺而善惊恐，心悲，内关主之”，这与焦虑障碍的诸多表现非常接近。现代研究证实，内关对于神志疾患疗效极佳[22],有宁心安神，宽胸理气之功效。
本针法根据女性周期分期辨证：月经期“重阳转阴”，选用合谷、三阴交、肝俞，补肾疏肝，散瘀行气，推动血海满溢、新旧交替，促进内膜脱落完全，性激素水平复原；卵泡期“胞宫空虚”，选用肓俞、子宫，补肾益精，化生气血，促进雌激素水平、卵泡充分发育、子宫内膜进入增生期；排卵期“重阴转阳”，选用水道、归来，宣散气血，调和阴阳，促进排卵，氤氲相合；黄体期“阳长”，选用三阴交、至阳、肾俞，温补肾元，温养胞宫，促进孕激素水平，内膜进入分泌期，温阳助孕，促进着床。根据患者辩证分型施治选穴：肾阳不足：月经期取肾俞，滤泡期取太溪、然谷（灸）、后溪，排卵期取足三里、太冲、头皮针生殖区（位于头部额角发际上2cm处），黄体期取命门、气海俞，以补肾温元，滋阴助阳；痰瘀内阻：月经期取次髎，滤泡期取阴陵泉、中脘（灸）、中极，排卵期阴陵泉、合谷、头皮针生殖区，黄体期脾俞、肝俞、委阳，以化痰祛湿，活血祛瘀；气血双虚：月经期取肾俞、次髎，滤泡期取三阴交、足三里，排卵期取足三里、三阴交、头皮针生殖区，黄体期取膈俞、列缺、照海，以补益气血。上述穴位相结合，共奏分期辩证与分型施治之功。
综上，本研究结果初步推测，基于“冲为血海”的分期针灸能有效改善薄型子宫内膜反复移植失败患者的焦虑情绪，从而改善“着床窗口期”子宫内膜厚度及类型，最终提高临床妊娠率及活产率。此法安全副作用少，可为薄型子宫内膜反复移植失败患者改善妊娠结局及心身疾病的治疗提供新思路。本病为难治性疾病，治疗周期较长，且由于研究样本量的局限性等原因，研究结论仍需今后大样本、多中心研究的支持。
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