蔡悦青1，魏炜2，张志毕3，吴文笛1，姜莉云1*，许云姣1
（1.昆明市中医医院，云南昆明，650000；2.云南中医药大学，云南昆明，650500；3.昆明医科大学生物医学工程研究中心，云南昆明，650500；）
（本论文荣获“第七届兰茂论坛”优秀论文一等奖）
摘要：目的：基于“补土伏火”理论从甲状腺激素角度研究四逆汤对肾阳虚证大鼠能量代谢的作用机制。方法：90只大鼠随机分为空白组、模型组、四逆汤全方组、四逆汤拆方组（附子组、甘草组、干姜组、甘草附子组、干姜附子组、甘草干姜组），除空白组外，以氢化可的松肌肉注射法造肾阳虚模型模，模型建立后分别给药，空白组和模型组予等量生理盐水，观察大鼠的一般情况、体重、体温及水食摄入的变化，检测血清促甲状腺激素释放激素（TRH）、促甲状腺激素（TSH）、三碘甲状腺原氨酸（T3）、甲状腺激素（又称四碘甲状腺原氨酸，T4）以及肝组织琥珀酸脱氢酶（SDH）、乳酸脱氢酶（LDH）、乳酸（LD）、磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（p-AMPK）的活性。结果：与空白组比较，造模后大鼠体重、水食的摄入情况、体温及TSH、T3、T4浓度均显著降低（P＜0.01），SDH活性显著下降（P＜0.01），LDH、p-AMPK活性显著升高，LD含量增多（P＜0.01）。与模型组比较，除甘草组外,其余各药物组体重、水食摄入量、体温、T3含量及SDH活性均有不同程度的增加（P＜0.05或P＜0.01），全方组和附子干姜组TSH、T4浓度显著增加（P＜0.05），全方组p-AMPK含量显著下降（P＜0.05）。与全方组比较，干姜组、甘草干姜组T3、T4的含量低于全方组（P＜0.05），甘草组体重、水食摄入情况、T3含量及SDH活性明显低于全方组（P＜0.01）；LDH、LD高于全方组（P＜0.05），甘草组和甘草干姜组p-AMPK含量高于全方组（P＜0.05）。结论：肾阳虚型大鼠肝脏组织有氧氧化水平降低，无氧酵解增加，能量代谢水平下降，TSH、T3、T4分泌减少；而四逆汤能促进大鼠肝脏组织的有氧氧化的功能，减少无氧氧化供能，从而改善大鼠的能量代谢，增加TSH、T3、T4的分泌，其中附子、干姜起主要作用。
关键词：补土伏火；四逆汤；能量代谢；
Study on the effect of Sini decoction on Energy Metabolism in Rats with Kidney Yang deficiency based on "tonifying soil and invigorating Fire"
Cai Yueqing1，Wei Wei2，Zhang Zhibi3，Wu Wendi1，Jiang Liyun1*，Xu Yunjiao1*
1.Yunnan University of TCM, Yunnan Kunming,650000; 2.Kunming Medical University Biomedical Engineering Research Center, Kunming 650500, China;3.Kunming Municipal Hospital of Traditional Chinese Medicine, Yunnan Kunming,650000;
Abstract: Objective: To study the mechanism of Sini decoction on energy metabolism in rats with kidney-yang deficiency syndrome from the point of view of thyroid hormone based on the theory of "tonifying soil and invigorating fire". Methods: 90 rats were randomly divided into blank group, model group, Sini decoction whole prescription group and Sini decoction disassembled prescription group (aconite group, licorice group, dried ginger group, licorice aconite group, dried ginger group and licorice dried ginger group). The model of kidney yang deficiency was established by intramuscular injection of hydrocortisone, and the blank group and model group were given the same amount of normal saline. Observe the changes of general condition, body weight, body temperature and water intake of rats, and detect serum thyrotropin-releasing hormone (TRH), thyroid-stimulating hormone (TSH), triiodothyronine (T3), thyroid hormone (also known as tetraiodothyronine). T4) and the activities of succinate dehydrogenase (SDH), lactate dehydrogenase (LDH), lactate (LD) and phosphorylated adenylate activated protein kinase (p-AMPK) in liver tissue.Results: compared with the blank group, the body weight, water intake, body temperature and the concentration of TSH, T3 and T4 in the model group were significantly lower than those in the blank group (P < 0 01). The activity of), SDH and the activity of p-AMPK increased significantly, and the content of LD increased significantly (P < 0 01). Compared with the model group, except the licorice group, the body weight, water intake, body temperature, T3 content and SDH activity in the other drug groups increased in different degrees. The concentrations of TSH and T4 in the whole prescription group and Fuzi dried ginger group increased significantly, while the p-AMPK content decreased significantly in the whole prescription group (P < 0.05). Compared with the whole prescription group, the contents of T3 and T4 in the dried ginger group and licorice dried ginger group were lower than those in the whole prescription group. The body weight, water intake, T3 content and SDH activity in the licorice group were significantly lower than those in the whole prescription group (P < 0.01); LDH, LD was higher than that in the whole prescription group). The p-AMPK content in licorice group and licorice dried ginger group was higher than that in the whole prescription group.Conclusion: the level of aerobic oxidation in liver tissue of rats with kidney yang deficiency decreased, the level of anaerobic glycolysis increased, the level of energy metabolism decreased, and the secretion of TSH, T3 and T4 decreased, while Sini decoction could promote the function of aerobic oxidation of liver tissue and reduce the energy supply of anaerobic oxidation, thus improving the energy metabolism of rats and increasing the secretion of TSH, T3 and T4, in which aconite and dried ginger played the main role.
Keywords: tonifying soil and invigorating fire; Sini decoction; energy metabolism;
《伤寒论》[1]中提出“少阴之为病，脉微细，但欲寐也。”并指出“少阴病，脉沉者，急温之，宜四逆汤。”郑钦安[2]曰:“按四逆汤一方，乃回阳之主方也，世多畏惧，由其不知仲景立方之意也,夫此方既列于寒入少阴，病见爪甲青黑，腹痛下利，大汗淋漓，身重畏寒，脉微欲绝，四肢逆冷之候，全是一团阴气为病，此际若不以四逆回阳，一线之阳光，即有欲绝之势，仲景于此，专主回阳以祛阴，是的确不易之法。细思此法, 既能回阳，则凡世之一切阳虚阴盛为病者，皆可服也，何必定要见以上病形而始放胆用之，未免不知几也。夫知几者，一见是阳虚证，而即以此方，在分两轻重上斟酌，预为防之，万不致酿成纯阴无阳之候也。酿成纯阴无阳之候，吾恐立方之固善，而追之不及……不知用姜附之不早也。”四逆汤是治疗少阴阳虚寒盛的基础方[3]，临床常用之治疗肾阳虚证[4-6]。
由于现代生活环境的改变，空调、熬夜、工作压力大等皆可导致阳气的耗散，故“阳虚者，十之八九”，肾阳为先天之阳，先天肾阳亏虚，肾水虚寒，命门火不能潜藏于肾水，浮越于外表现出虚火之证，此时应用大辛大热之药无疑是火上浇油，故扶阳派鼻祖郑钦安在《医理真传》[2]中提出“补土伏火”法，将其形象的比喻为火和灰的关系。“补土伏火”实则包含两层含义，一是伏药物之火，二是伏人体自身外越之虚火；本研究旨在探讨四逆汤组方中“补土伏火”的体现，即伏药物之火。
目前对于四逆汤的研究主要体现药理病理实验、仪器分析、分子生物学等方面，研究四逆汤治疗肾阳虚证的作用机制甚少；对四逆汤配伍的研究多是从化学成分和药理实验角度进行阐释的，这些研究多过于单一，未阐述四逆汤中药材配伍后的变化，目前有关四逆汤的拆方研究及对其配伍的重要原则“补土伏火”的微观实验研究暂无相关报道。本研究旨在基于“补土伏火”的理论，从能量代谢角度研究四逆汤对肾阳虚证大鼠的影响。
1. 材料
1.1 动物：SD大鼠90只，雄性，220±30g，购买自昆明医科大学实验动物学部，生产许可证号：SCXK（滇）2015-004。
1.2 实验药物：四逆汤（康仁堂中药配方颗粒），昆明市中医医院提供。四逆汤配制：炙甘草10 g、炙附子100 g、干姜20 g，加入300 ml热水，搅拌均匀制成（拆方组单味药用量与四逆汤全方组相同，即附子干姜组为炙附子100 g、干姜20 g，加入300 ml热水搅拌均匀；附子甘草组为炙附子100 g、炙甘草10 g，加入300 ml热水搅拌均匀；干姜甘草组为干姜20 g、炙甘草10 g，加入300 ml热水搅拌均匀；同理附子组为炙附子100 g加入300 ml热水搅拌均匀；干姜组为干姜20 g加入300 ml热水搅拌均匀；甘草组为炙甘草10 g加入300 ml热水搅拌均匀）。
1.3 试剂：氢化可的松（华中药业股份有限公司、批号20170710）、大鼠游离甲状腺素(FT4)ELISA检测试剂盒（上海酶联生物研究所，批号03/2018）、大鼠游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)ELISA检测试剂盒（上海酶联生物研究所，批号03/2018）、大鼠促甲状腺素释放激素(TRH)ELISA检测试剂盒（上海酶联生物研究所，批号03/2018）、大鼠促甲状腺素(TSH)ELISA检测试剂盒（上海酶联生物研究所，批号03/2018）。
1.4 仪器：Synergy2 型多功能酶标仪( 美国Bio-Tek公司)、CHB-100 型恒温金属浴( 杭州博日科技有限公司) ；ND-1000型核酸蛋白检测仪( 美国BDT公司)、Centrifuge 5804R 冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；
2.方法
2.1 动物分组及饲养 SD大鼠90只，随机分为9个组（空白组、模型组、四逆汤全方组、附子组、甘草组、干姜组、甘草附子组、干姜附子组、甘草干姜组），每组10只。饲养条件：温度20±2 ℃，相对湿度60 %-70 %，水食自取。
2.2 肾阳虚证大鼠模型建立 大鼠适应性饲养1周后造模，除空白组外，大鼠后肢肌肉注射氢化可的松注射液，剂量25 mg/kg·d，空白组注射等量生理盐水，共注射15天[8-10]。
2.3 给药及取材 模型建立后各组大鼠给药给药量为10 ml/kg，空白组和模型组灌胃等量生理盐水，每天给药2次，共给药14天。末次给药结束后，大鼠禁食不禁水24 h后取材。
2.4 检测指标
2.4.1 大鼠形态学观察 记录大鼠体重，测量大鼠给药前后水食摄入量，温度计测量大鼠给药前后体温（肛温）。
2.4.2 样本采集 给药结束后大鼠腹腔注射4 %水合氯醛10 ml/kg，麻醉大鼠，然后取大鼠血液2ml，室温放置20 min后4度10000 rmp离心10 min，分离得到血清，血清分装保存于-80 ℃。
2.4.3 血清葡萄糖含量、甲状腺功能指标（FT3、FT4、TSH、TRH）检测 根据试剂盒操作说明，血清葡萄糖含量采用葡萄糖氧化酶偶联法检测；血清FT3、FT4、TSH、TRH含量采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测。
2.5 统计学处理 采用 GraphPad Prism5.0统计软件进行统计分析，数据以平均数±标准差（）表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05代表差异有统计学意义。
3. 结果
3.1 一般观察：空白组大鼠毛色顺滑，好动、精神状态活跃；模型组大鼠出现了毛色枯槁、精神状态萎靡、少动、喜欢扎堆、大便溏稀等症状；给药后，药物组大鼠一般状态与模型组类似，但有一定程度的改善。
3.2 大鼠体重
造模前各组大鼠体重无明显差异；氢化可的松注射造模后，与空白组比较，各组大鼠体重都显著低于空白组（P＜0.01），各个造模组之间体重无显著差异；给药后，与空白组比较，各组大鼠体重仍显著低于空白组（P＜0.01）；与模型组比较，除甘草组外,其余各药物组体重均显著高于模型组（P＜0.01）；与全方组比较，甘草组大鼠体重低于全方组，其余拆方组与全方组体重无明显差异，详见表1。
表 1 大鼠体重情况（，n = 10）
| 组别 | 造模前（g） | 给药前（g） | 给药后（g） |
| 空白组 | 247.62±22.33 | 328.94±30.82df | 376.29±24.16df |
| 模型组 | 241.21±25.22 | 238.41±23.52b | 253.64±25.06 bf |
| 四逆汤全方组 | 258.65±24.17 | 241.16±26.31 b | 292.14±22.13 bd |
| 附子组 | 251.93±22.88 | 233.26±24.02 b | 287.16±24.09 bd |
| 甘草组 | 238.69±23.13 | 251.15±21.09 b | 262.91±25.61 be |
| 干姜组 | 244.64±20.93 | 255.45±21.16 b | 278.16±26.33 bd |
| 甘草附子组 | 246.72±19.86 | 245.39±21.87 b | 274.16±19.94 bd |
| 干姜附子组 | 247.13±18.77 | 246.39±28.71 b | 284.19±20.33 bd |
| 甘草干姜组 | 258.33±16.85 | 257.46±24.75 b | 277.19±18.98 bd |
注：与空白组比较，aP＜0.05，bP＜0.01；与模型组比较，cP＜0.05，dP＜0.01;与全方组比较eP＜0.05，fP＜0.01（下同）。
3.3 水、食摄入情况
给药前，与空白组比较，模型组和各药物组大鼠水、食的摄入情况都显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，各药物组大鼠水、食摄入量并无显著差异。给药后，与空白组比较，模型组大鼠的水食摄入仍然显著低于空白组（P＜0.01），各药物组的水摄入量仍显著低于空白组（P＜0.01），但除甘草组（P＜0.05）外，其余各药物组食物摄入量与空白组无差异；与模型组比较，各药物组的水食摄入都显著的增加（P＜0.05或（P＜0.01）；与全方组比较，除甘草组水摄入量低于全方组，其余拆方组与全方组水食摄入量无差异，详见表2。
表 2 给药前后大鼠水食摄入情况（，n = 10）
| 组别 | 给药前 | 给药后 | ||
| 水（g） | 食（g） | 水（g） | 食（g） | |
| 空白组 | 45.54±6.33df | 25.33±2.54df | 42.39±6.54df | 26.01±3.31d |
| 模型组 | 31.21±5.48b | 18.56±3.21 b | 30.16±5.44 bf | 17.96±3.56 bf |
| 四逆汤全方组 | 29.32±4.85 b | 18.46±4.02 b | 37.26±4.28bd | 24.03±3.25 d |
| 附子组 | 32.16±5.88 b | 17.65±3.45 b | 38.16±6.01 bd | 23.36±2.49 c |
| 甘草组 | 30.09±7.16 b | 16.97±3.94 b | 33.26±4.12 be | 22.03±3.14 ac |
| 干姜组 | 27.49±3.49 b | 18.67±4.34 b | 37.87±4.62 bd | 25.12±4.01 d |
| 甘草附子组 | 30.25±6.06 b | 17.79±5.09 b | 37.09±4.99 bd | 25.36±2.93 d |
| 干姜附子组 | 28.94±4.85 b | 17.68±3.47 b | 36.54±5.47 bd | 24.16±3.01 d |
| 甘草干姜组 | 31.07±7.51 b | 18.91±5.02 b | 36.78±4.54 bd | 23.64±3.84 d |
3.4 大鼠血糖浓度
给药结束后，禁食24h，检测大鼠空腹血糖。结果发现，各组大鼠之间血糖浓度并无显著的差异，详见表3。
表 3 大鼠血糖浓度（，n = 10）
| 组别 | 血糖（mmol/L） |
| 空白组 | 5.38±0.84 |
| 模型组 | 5.44±0.87 |
| 四逆汤全方组 | 5.36±1.02 |
| 附子组 | 5.68±1.09 |
| 甘草组 | 5.22±0.98 |
| 干姜组 | 5.33±0.78 |
| 甘草附子组 | 5.47±1.06 |
| 干姜附子组 | 5.39±0.96 |
| 甘草干姜组 | 5.64±1.05 |
3.5 大鼠体温
给药前，与空白组比较，各组大鼠体温均显著降低（P＜0.01）；给药后，与空白组比较，模型组大鼠体温虽然有一定程度的恢复，但是仍然未完全恢复到正常体温；与模型组比较，除甘草组外，其余各药物组大鼠体温都有不同程度的升高（P＜0.05或P＜0.01），已接近空白组大鼠体温（P>0.05），甘草组大鼠体温有一定程度的恢复，但是体温还是显著低于空白组（P＜0.05）；与全方组比较，拆方组的体温与全方组无明显差异，详见表4。
表 4 给药前后大鼠温度变化情况（，n = 10）
| 组别 | 给药前（℃） | 给药后（℃） |
| 空白组 | 38.05±0.34df | 38.11±0.36d |
| 模型组 | 37.04±0.25b | 37.26±0.16 be |
| 四逆汤全方组 | 37.01±0.16 b | 37.89±0.34c |
| 附子组 | 36.94±0.18 b | 37.87±0.25 c |
| 甘草组 | 37.06±0.15 b | 37.45±0.31a |
| 干姜组 | 36.98±0.32 b | 37.77±0.20 c |
| 甘草附子组 | 37.01±0.26 b | 37.83±0.23 c |
| 干姜附子组 | 37.11±0.26 b | 37.79±0.21 c |
| 甘草干姜组 | 37.06±0.19 b | 37.68±0.24 ac |
3.6 甲状腺相关指标检测
检测发现，与空白组比较，模型组大鼠T3、T4浓度都显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，除甘草组外，其余药物组T3含量都有不同程度的增加（P＜0.05或P＜0.01）；而在T4指标中，只有全方组和干姜附子组T4浓度显著增加（P＜0.05），其余组变化都不明显（P>0.05）；与全方组比较，干姜组、甘草干姜组T3、T4的含量低于全方组（P＜0.05），甘草组T3的含量明显低于全方组（P＜0.01），详见表5。
与空白组比较，模型组大鼠TSH浓度显著下降（P＜0.01），而TRH浓度并无显著差异；与模型组比较，全方组和附子干姜组TSH的浓度显著增加（P＜0.05），而其他药物组TSH浓度无显著变化，各药物组TRH浓度与模型组比较无显著差异；与全方组比较，各药物组TSH、TRH的含量无明显差异；详见表5。
表5 大鼠血清T3、T4、TSH、TRH浓度变化情况（，n = 10）
| 组别 |
T3 ng/L |
T4 ug/L |
TSH mU/L |
TRH uU/L |
| 空白组 | 189.02±35.03d | 212.33±35.61df | 11.23±1.38df | 5.36±0.89 |
| 模型组 | 128.33±45.62bf | 166.24±44.30 be | 8.36±1.06 be | 6.03±1.02 |
| 四逆汤全方组 | 182.06±41.25d | 189.32±36.35 bc | 9.28±1.08 bc | 6.31±1.32 |
| 附子组 | 163.32±29.38 ad | 171.35±36.35 b | 8.63±0.89 b | 5.98±1.02 |
| 甘草组 | 135.02±62.01 bf | 173.21±26.21 b | 8.66±1.24 b | 6.01±0.87 |
| 干姜组 | 149.35±26.33 bce | 169.35±23.35 be | 8.67±1.22 b | 5.68±0.78 |
| 甘草附子组 | 171.06±51.06bd | 172.06±36.28 b | 9.05±2.03 b | 6.33±0.98 |
| 干姜附子组 | 176.22±32.04 d | 187.56±35.24 bc | 9.31±1.87 bc | 6.24±1.22 |
| 甘草干姜组 | 156.32±29.67 bce | 165.03±34.01 be | 8.89±1.26 b | 6.05±1.35 |
3.7大鼠肝脏组织能量代谢琥珀酸脱氢酶（SDH）、乳酸脱氢酶（LDH）、乳酸（LD）、磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（p-AMPK）活性
3.7.1琥珀酸脱氢酶（SDH）
与空白组比较，模型组大鼠肝脏组织SDH活性显著下降（P＜0.01）；与模型组比较，除甘草组外，其余药物组大鼠肝脏SDH活性都有显著的增加（P＜0.05或P＜0.01）；与全方组比较，甘草组的大鼠肝脏SDH活性显著低于全方组（P＜0.01），其余拆方组与全方组无显著差异，详见表6。
3.7.2乳酸脱氢酶（LDH）、乳酸（LD）
与空白组比较，模型组大鼠中肝脏组织中LDH活性显著升高，LD含量增多（P＜0.01）；与模型组比较，全方组和附子组、附子甘草组大鼠肝脏组织LDH活性显著下降（P＜0.05），其余组LDH变化不明显，而LD的含量，除甘草组，其余各组均有所下降（P＜0.05）；与全方组比较，除甘草组LDH、LD高于全方组（P＜0.05），其余拆方组与全方组无显著差异，详见表6。
3.7.3磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（p-AMPK）
与空白组比较，模型组大鼠肝脏组织中p-AMPK显著增加（P＜0.01）；与模型组比较，只有全方组p-AMPK含量显著下降（P＜0.05），其余各药物组p-AMPK含量与模型组比较无显著差异；与全方组比较，除甘草组和甘草干姜组p-AMPK含量高于全方组（P＜0.05），其余拆方组与全方组无显著差异，详见表6。
表 6 鼠肝组织SDH、LDH、LD、p-AMPK活性（，n = 10）
| 组别 |
SDH U/mgprot |
LDH U/gprot |
LD umol/ gprot |
p-AMPK ng/mgprot |
| 空白组 | 16.85±2.12de | 5221.32±375.01de | 390.12±69.27df | 3.52±0.78f |
| 模型组 | 11.30±1.96bf | 6602.12±431.05be | 768.21±96.35be | 7.25±1.21be |
| 四逆汤全方组 | 15.33±1.59 ad | 5927.78±487.16 ac | 644.21±101.23bc | 6.48±1.02bc |
| 附子组 | 15.02±1.36d | 6106.28±512.33bc | 674.24±89.22bc | 6.97±1.33b |
| 甘草组 | 12.02±2.01bf | 6701.01±506.31be | 766.31±87.77be | 7.33±0.95be |
| 干姜组 | 15.36±1.88d | 6312.15±335.27b | 635.26±98.91bc | 6.87±1.14b |
| 甘草附子组 | 15.36±2.54d | 6213.08±369.48bc | 625.64±74.48bc | 6.99±0.88b |
| 干姜附子组 | 15.18±2.14d | 6299.18±540.01a | 654.32±87.16bc | 7.12±1.02b |
| 甘草干姜组 | 14.92±2.33c | 6314.15±487.69b | 625.26±68.59bc | 7.54±1.26be |
4. 讨论
多项研究结果[7-9]已经显示注射氢化可的松所可诱导肾阳虚型大鼠模型，氢化可的松的摄入会导致大鼠内分泌系统激素水平发生紊乱。甲状腺激素（TH）包括甲状腺素（T4，又称四碘甲腺原氨酸）和三碘甲腺原氨酸（T3），是细胞代谢的关键因素，通过多种途径参与不同靶组织中碳水化合物、脂质和蛋白质的代谢[10-11]。促甲状腺激素（TSH）是垂体分泌的促进甲状腺释放的激素，能促进T3和T4的合成。肾阳虚型大鼠TSH、T3、T4含量均显著降低，考虑氢化可的松所致的肾阳虚型大鼠影响大鼠下丘脑-垂体-甲状腺轴（HPT），TSH分泌减少，进而导致TH也随之减少。促甲状腺激素释放激素（TRH）是由于下丘脑分泌的垂体激素，能诱导促甲状腺细胞合成与释放TSH，下丘脑神经元的活动受多种神经纤维的支配，如以儿茶酚胺、神经肽Y（NPY）、粗黑素、生长抑素等为递质的神经纤维，且TH主要负反馈调节腺垂体TSH细胞对TRH的敏感性以及TSH的合成和分泌[12-13]。本研究发现肾阳虚型大鼠以及各药物组大鼠TRH含量与正常大鼠无明显区别，这可能与TRH代谢的代偿机制有关。
本研究对氢化可的松诱导的肾阳虚证大鼠灌服四逆汤及其拆方药物，发现用药后全方组及附子干姜组TSH明显升高，而附子和干姜均能显著促进T3的分泌，二者联合应用时能促进T4的分泌，而甘草并不具有促进T3、T4分泌的作用，表明四逆汤可以改善肾阳虚型大鼠的能量代谢，且主要是附子、干姜起作用。此研究结果与多项研究结果基本相符[5，14-15]，且与中医“附子无姜不热”的理论一致。
能量代谢是机体生命活动的基本特征，葡萄糖作为人体能量的主要来源，在体内的代谢主要有两条途径，即有氧氧化和无氧酵解，三羧酸循环是机体有氧氧化供能的主要途径。琥珀酸脱氢酶（SDH）位于线粒体内膜上，其活性变化常与线粒体的损伤并行出现，故通常以SDH活性的高低来评价有氧氧化能力的高低[16]。糖酵解是机体在缺氧情况下提供能量的一条重要途径。LDH是无氧氧化的标志酶，而LD是无氧氧化的代谢产物，所以LDH和LD含量的测定可以反映组织组织氧供和代谢状态。腺苷酸激活蛋白激酶 (AMPK) 在细胞能量稳态调节中起到关键作用[17]。在应激状态下，AMPK 磷酸化形成p-AMPK）。作为细胞能量感受器，p-AMPK可对补充细胞 ATP 供应的信号转导通路做出正向调控，增强胰岛素的敏感性，减少肝糖的输出。
研究结果显示肾阳虚大鼠肝组织中SDH活性显著下降，LDH活性显著升高、LD及p-AMPK含量显著增加，提示其有氧氧化水平降低，无氧酵解增加，能量代谢水平下降。而四逆汤对大鼠肝脏组织的有氧氧化功能具有促进作用，无氧氧化供能相应的减少，而且是附子起主要作用，从而提高肝脏能量代谢水平，恢复大鼠体温。此外AMPK的活化表明肾阳虚型大鼠处于应激状态，四逆汤各成分综合发挥作用，改善了肾阳虚大鼠肝脏组织能量代谢水平低下的状态，各成分拆开后单独或两两组合使用时对AMPK的活化无显著的调控作用，本结果与多项研究结果一致[18-20]。
四逆汤组方以大辛大热之生附子为君，温壮元阳，破散阴寒，回阳救逆。臣以辛热之干姜，温中散寒，助阳通脉。炙甘草之用有三：一则益气补中，使全方温补结合，以治虚寒之本；二则甘缓姜、附峻烈之性，使破阴回阳而无暴散之虞；三则调和药性，并使药力作用持久。三药合用，共奏温补脾肾，回阳救逆之功。“补土伏火”[21-22]是基于五行理论中土与火的关系衍生的中医治疗法则，其主要包括两层含义，一是补中焦脾胃而助生理之真火;二是补中焦脾胃而能够潜降上越的虚火。郑钦安在《医理真传·伏火说》[2]中提出：“世多不识伏火之义，即不达古人用药之妙也，余试为之喻焉：如今之人将火煽红，而不覆之以灰，虽焰，不久即灭，覆之以灰，火得伏即可久存。古人通造化之微，用一药、立一方，皆有深义。若附子甘草二物，附子即火也，甘草即土也。古人云：“热不过附子，甜不过甘草”。推其极也，古人以药性之至极，即以补人身立命之至极，二物相需并用，亦寓回阳之义，亦寓先后并补之义，亦寓相生之义，亦寓伏火之义，不可不知。”并在封髓丹方解中提出甘草伏火, 是指甘草补土之虚而能伏元阳外越之虚火，四逆汤、潜阳丹方解中均视甘草为伏藏真火之品。
本研究旨在基于“补土伏火”研究四逆汤在肾阳虚型大鼠能量代谢的影响，但本实验结果中全方组与附子组、附子干姜组无明显区别，未能体现甘草对附子的伏火之义，故接下来的研究需进一步探讨甘草对附子的伏火机制。
参考文献：
[1]张仲景.伤寒论[M].北京:中国医药科技出版社,2017.
[2]郑钦安.医理真传[M].北京:中国中医药出版社,2008.
[3]于晓,郭霞珍.再议四逆汤治法[J].中华中医药杂志,2018,33(08):3403-3405.
[4]吴元坤.吴佩衡论“四逆汤”及其临床效验[J].云南中医学院学报,1986(04):35-37.
[5]丁雯. 四逆汤对肾阳虚危重症患者甲状腺功能的影响[D].广州中医药大学,2016.
[6]Tang Nong,Liu Lihong,Qiu Hua,Shi Wei,Mao Dewen. Analysis of gene expression and functional changes of adrenal gland in a rat model of kidney yang deficiency syndrome treated with Sini decoction.[J]. Experimental and therapeutic medicine,2018,16(4).
[7]童骏峰，徐志伟等.腺嘌呤与氢化可的松所致大鼠肾阳虚证模型比较研究[J],中华中医药杂志,2015,11(30):3901-3903.
[8]戴冰,张嘉妮,杨梦琳,等.氢化可的松致肾虚证小鼠模型的建立及相关指标的评价[J].中国实验动物学报,2017,25(01):70-73.
[9]马晓宇,姜梦如,张涛,杨英.氢化可的松诱导大鼠肾阳虚模型评价[J].中国兽医学报,2017,37(09):1763-1765.
[10]Yavuz Sahzene,Salgado Nunez Del Prado Silvia,Celi Francesco S. Thyroid Hormone Action and Energy Expenditure.[J]. Journal of the Endocrine Society,2019,3(7).
[11]Cicatiello Annunziata G,Di Girolamo Daniela,Dentice Monica. Metabolic Effects of the Intracellular Regulation of Thyroid Hormone: Old Players, New Concepts.[J]. Frontiers in endocrinology,2018,9.
[12]Sugrue Michelle L,Vella Kristen R,Morales Crystal,Lopez Marisol E,Hollenberg Anthony N. The thyrotropin-releasing hormone gene is regulated by thyroid hormone at the level of transcription in vivo.[J]. Endocrinology,2009,151(2).
[13]朱大年.生理学(第八版)[M].北京:人民卫生出版社,2013.
[14]高娜. 附子对虚寒证大鼠能量代谢影响及机制的初步研究[D].山东中医药大学,2011.
[15]马清翠. 附子、干姜、黄连、大黄对正常大鼠寒热表征和能量代谢的影响[D].山东中医药大学,2010.
[16]Armin Edalat,Philipp Schulte-Mecklenbeck,Cita Bauer,et al.Mitochondrial succinate dehydrogenase is involvedin stimulus-secretion coupling and endogenous ROS formationin murine beta cells[J].Diabetologia,2015,58:1532-1541.
[17]Séverine Olivier,Marc Foretz,Benoit Viollet. Promise and challenges for direct small molecule AMPK activators[J]. Biochemical Pharmacology,2018,153.
[18]赵俭,韩冰冰,高娜,等.附子对虚寒模型大鼠肝组织糖原、LD含量、LDH活力及肝SDH、ATP酶活力的影响[J].辽宁中医杂志,2011,38(07):1455-1456.
[19]臧树成,郭文晋,甄莉,等.亚低温对大鼠肝细胞能量代谢中关键酶LDH、SDH和MDH活性以及PA含量的影响[J].黑龙江畜牧兽医,2018(18):194-196,203.
[20]黄丽萍,彭淑红,胡强,蒙晓芳,余日跃,刘红宁,孙建宁.6味热性中药对大鼠骨骼肌能量代谢相关因子的影响[J].中华中医药杂志,2010,25(02):228-230.
[21]张胜男,齐文升.“补土伏火”理论源流及运用[J].北京中医药,2019,38(06):574-576.
[22]姚鹏宇,孟庆松,程广清.“补土伏火”学说探析[J].中医药导报,2018,24(22):15-16+24.