基于网络药理学探讨温阳通络方治疗类风湿关节炎的作用机制

　　汪宗清1 聂红科1 李青璇1 王兴强2  陈晨1 吕志安1 候卫1 汤小虎1,2* 彭江云1,2

　　(1.云南中医药大学  云南 昆明 650500;2.云南中医药大学第一附属医院 云南昆明 650032)

（本论文荣获“第七届兰茂论坛”优秀论文二等奖）

　　摘要：目的：基于网络药理学探讨温阳通络方治疗类风湿关节炎（RA）的作用机制。方法：利用TCMSP、Pubchem、Swiss Target Prediction数据库挖掘温阳通络方中的中药所含化学成分及作用靶点并经Uniprot数据库标准化，通过GeneCards数据库获得RA相关基因，韦恩图获得交集基因，Cytoscape3.7.2软件构建活性成分-关键靶点网络，STRING数据库下载蛋白-蛋白相互作用（PPI）数据，筛选相互作用图的核心靶点，利用R语言clusterProfiler包进行GO功能和KEGG通路富集分析,并构建“靶点-通路”网络。结果：筛选得到119个化合物及相应靶点383个，关键成分包括槲皮素、藤黄菌素、去氧乌头碱、山奈酚、黄芩素、柚皮素、β-谷甾醇等,关键靶点包括早期原癌基因、丝裂原活化蛋白激酶1/14、丝氨酸蛋白激酶1、白介素-6/1β/4/2、表皮生长因子受体等。GO功能富集分析，包括生物学过程1766条，分子功能101条，细胞组成27条；KEGG通路富集分析显示131条通路,主要涉及糖尿病并发症的AGE-RAGE信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化、IL-17信号通路、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、Th17细胞分化等。结论：温阳通络方可能通过抑制炎症反应、调节免疫功能及调控细胞凋亡等多条通路来治疗RA。[基金项目：中医药行业科研专项项目(201507001-07);国家自然科学基金项目(81060285);云南省卫生科技计划项目(2017NS165)；

　　作者简介：汪宗清(1995-)，女(汉族)，云南昭通人，在读硕士，从事中医药防治风湿病研究，Tel：18469117341,E-mail：wangzongqing1909@126.com;汤小虎*,(1964-)，男(白族),教授,博士生导师,从事中医药防治风湿病研究，Tel：0871-63639262，E-mail：tigerlet_tcm@126.com;]

　　关键词：温阳通络方；蠲痹颗粒；类风湿关节炎；网络药理学；

　　Mechanism of Wenyang Tongluo Prescription

　　in Treating Rheumatoid Arthritis Based on Network Pharmacology Approach

　　WANG Zong-qing1,NIE Hong-ke1, LI Qing-xuan1,WANG Xing-qiang2 CHEN Chen1,LV Zhi-an1, HOU Wei1,TANG Xiao-hu1,2*,PENG Jiang-yun

　　(1.Yunnan University of Traditional Chinese Medicine,Kunming ,650500,China;2.The First Affiliated Hospital of Yunnan University of Traditional Chinese Medicine,Kunming,650032,China)

　　Abstract:Objective:To investigate active ingredients, targets and pathways of Wenyang Tongluo Prescription in the treatment of rheumatoid arthritis (RA) by using network pharmacology technology.Methods:Firstly, the chemical components and targets of traditional Chinese medicine in Wenyang Tongluo Prescription were collected from the database of TCMSP, ETCM, Pubchen and Swiss Target Prediction, and then standardized by Uniprot database.RA related genes were obtained by GeneCards database, related intersection was obtained by Venn diagram, and the network of active ingredients and key targets was constructed by Cytoscape3.7.2 software.The protein-protein interaction (PPI) data were downloaded with STRING, and the core targets of the interaction map of screened component targets and disease targets were further analyzed with GO using the R language clusterProfiler package, and the core targets were enriched by KEGG database. Results:119 compounds and 383 targets were screened. The key active components include quercetin, luteolin, kaempferol, deoxyaconitine, baicalein, naringenin, beta-sitosterol,etc.Key targets include JUN, MAPK1, AKT1, IL6/1β/4/2, MAPK1/14, EGFR, etc. GO function enrichment analysis included 1766 biological processes, 101 molecular functions, 27 cell components;KEGG pathway enrichment analysis revealed 131 pathways, including AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications,TNF signaling pathway,Fluid shear stress and atherosclerosis,IL−17 signaling pathway,Kaposi sarcoma−associated herpesvirus infection,Th17 cell differentiation.Conclusion:Wenyang Tongluo prescription has the characteristics of multi-component and multi-target, and may treat RA by inhibiting inflammatory response, regulating immune function and adjust apoptosis.

　　Keyword:Wenyang Tongluo Prescription;Juanbi Granules;Rheumatoid arthritis;Network pharmacology;

　　类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)属于全身性、自身免疫性炎症性疾病 ，其基本病理表现为滑膜炎和血管翳的形成，并逐渐出现关节软骨和骨破坏，最终导致关节畸形和功能丧失，严重影响患者生存质量[1] 。RA属于中医学“痹证”范畴[2],《素问·痹论》言:“风寒湿三气杂至,合而为痹也。”吴生元[3]认为肾阳不足、气血亏虚是本病发病的内在病因,外邪及痰瘀痹阻,阳气流通闭塞，是本病的重要外在原因。在临证过程中,常三痹合治,以散寒为主要治法,温阳益肾、活血通络为辅,兼具祛邪通阳和补虚扶阳,两者相得益彰,达到治疗RA的目的。

　　温阳通络方（蠲痹颗粒）为吴生元在继承云南吴氏扶阳流派学术思想的基础上，结合多年治疗痹证的临床经验，以桂枝附子汤和麻黄附子细辛汤为基础，化裁拟定而成，现作为云南中医药大学第一附属医院有效院内制剂，在云南20余家医院广泛使用。多年的临床实践研究及动物实验研究表明,温阳通络方对RA具有良好的临床疗效及安全性[4-9]，但缺乏系统的研究。因此，基于前期研究基础，本文运用网络药理学的研究方法，以求更为全面了解温阳通络汤的机制,为其更加深入的机制研究奠定基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 数据库与软件

　　数据库和软件主要包括:TCMSP数据库（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）、Pubchem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、Swiss Target Prediction数据库（http://www.swisstargetprediction.ch/）、GeneCards数据库（https://www.genecards.org/）、Uniport数据库（http://www.uniprot.org/）、STRING数据库（https://string-db.org/）、GO数据库(http://geneontology.org/)、KEGG数据库（https://www.kegg.jp/）、Venny(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/) 、Cytoscape3.7.2软件(https://cytoscape.org/)、R3.6.2软件(https://mirrors.tongji.edu.cn/CRAN/)。

　　1.2 温阳通络方的化学成分

　　通过TCMSP数据库检索温阳通络全方附子、桂枝、细辛、麻黄、羌活、独活、青风藤、透骨草、五加皮、赤芍、川芎、薏苡仁12味所有化学成分，删选条件为口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18、药物对小肠上皮细胞穿透性(Caco-2)≥-0.4[10]。

　　1.3 温阳通络方相关靶点

　　TCMSP数据库查询活性成分相关的靶点，如该数据库中无对应靶点，则进一步通过Pubchem数据库检索活性成分，并查询它们所对应的2D结构，保存为SDF文件，上传至Swiss Target Prediction数据库，基于反向分子对接原理进行靶点预测，得到相关的预测靶点。整合以上靶点并去重。最后将筛选得到的所有靶点均经antiproton数据库转化成蛋白质ID格式，以便于后续处理分析。

　　1.4 RA相关靶点的获取及与温阳通络方靶点的映射

　　通过Gene Cards数据库获取疾病相关靶点，以“rheumatoid arthritis”作为检索词，根据Relevance score≥5进行筛选，将温阳通络方靶基因与RA相关基因用R软件进行映射，筛选出共同靶基因，利用R软件制作韦恩图。

　　1.5 活性成分-靶点网络构建

　　利用Cytoscape 3.7.2软件，将上述得到的活性成分、共同靶基因数据导入软件中，制作“活性成分-靶点网络图”，并计算其Degree值，筛选出核心成分。

　　1.6 蛋白互相作用网络的构建与核心靶点的分析

　　将共同靶基因数据导入String数据库，物种选择为“Homo Sapience”进行PPI网络互作图，设置连接评分最小值为0.900，获得蛋白互作关系，导出TSV文件。通过R语言计算各主要蛋白之间的互作次数，并据此找到核心靶点，生成barplot条形图。

　　1.7 基因本体 (GO) 功能富集京都基因与基因组百科全书 (KEGG) 通路富集分析

　　将共同靶基因转换成entrezID。然后在R软件安装“clusterProfiler”包，根据已转换的entrezID，以P<0.05进行关键靶基因的GO和KEGG功能富集分析，GO富集分析又包括生物过程(biological process, BP)、分子功能(molucular function, MF)和细胞组分(cellular component, CC)3个分支。结果以条形图和气泡图形式输出。

　　1.8 靶点-作用通路网络的构建

　　将生成的靶点-通路关系文件导入Cytoscape 3.7.2软件，构建“靶点-作用通路”网络。

　　2 结果

　　2.1 温阳通络方活性成分和潜在靶点

　　通过筛选条件，从TCMSP数据库中共获得温阳通络方119个活性成分。其中附子16个、桂枝7个、细辛8个、麻黄21个、羌活12个、独活8个、青风藤6个、透骨草3个、五加皮3个、赤芍20个、川芎6个、薏苡仁9个。整合TCMSP和Swiss Target Prediction数据库预测，以及通过Uniprot数据库校正去重，共获得383个化合物相关潜在靶点。

　　2.2 RA相关基因

　　在Genecards数据库中共找到4157个RA相关基因，评分排名前10的靶点分别是白细胞介素6(IL-6)、人类白细胞抗原组织相容复合物DRβ1(HLA-DRβ1) 、肿瘤坏死因子(TNF)、蛋白酪氨酸磷酸酶非受体型22(PTPN22)、白介素2受体α(IL2Ra)、白细胞介素10(IL-10)、信号传导转录激活因子4(STAT4)、4型肽精氨酸转亚胺基酶(PADI4)、巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)、白细胞介素1β(IL-1β),根据Relevance score≥5进行筛选，共获得655个相关基因，与温阳通络方活性成分潜在靶点对比，共有91个共同基因，韦恩图见图1。

　　图1 活性化合物-疾病交集基因韦恩图  

　　Fig.1 Venn diagram of active compounds-disease intersecting genes

　　2.3 化合物-靶点网络网络的构建

　　将生成的成分-靶点关系导入Cytoscape 3.7.2软件，绘制网络图，删除游离及连接节点小于2的点，结果见图2。图中黄色为共同基因，蓝色表示温阳通络方中能与这些基因反应的有效成分，并对该网络图中的每个节点的Degree进行分析。Degree在活性成分节点表示该活性成分所对应的靶点个数，这意味着Degree值越大，在治疗RA的过程中所发挥的作用也越大。可得出前7位核心成分为槲皮素（quercetin）、藤黄菌素(luteolin)、 山柰酚(kaempferol)、去氧乌头碱(deoxyaconitine)、黄芩素(baicalein) 、柚皮素(naringenin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)，分别能与61、28、22、15、13、12、11个靶点连接，对治疗RA具有重要的意义，具体见表1，选取Degree≥5的活性成分进行展示。

　　图2 活性成分-作用靶点网络   

　　Fig.2 components-targets network

　　表1 关键化合物的基本信息(Degree≥5)

　　Table 1 The basic information on the key compounds(Degree≥5)

TCMSP-ID	Compound	OB%	DL	Caco-2	Degree	Herbs
MOL000098	Quercetin	46.43	0.28	0.05	61	MH,TGC
MOL000006	luteolin	36.16	0.25	0.19	28	MH
MOL000422	kaempferol	41.88	0.24	0.26	22	MH,TGC,XX
MOL002416	deoxyaconitine	30.96	0.24	0.23	15	FZ
MOL002714	baicalein	33.52	0.21	-0.05	13	CS
MOL004328	naringenin	59.29	0.21	0.28	12	MH
MOL000358	beta-sitosterol	36.91	0.75	0.75	11	MH,CS,GZ,DH,QH,QFT
MOL002135	Myricanone	40.60	0.51	0.67	9	CX
MOL002401	Neokadsuranic acid B	43.10	0.85	0.69	8	FZ
MOL000621	16-epi-Isositsirikine	49.52	0.59	0.68	7	QFT
MOL002410	benzoylnapelline	34.06	0.53	0.19	7	FZ
MOL002962	(3S)-7-hydroxy-3-(2,3,4-trimethoxyphenyl)chroman-4-one	48.23	0.33	0.62	7	XX
MOL001460	Cryptopin	78.74	0.72	0.79	6	XX
MOL005573	Genkwanin	37.13	0.24	0.63	6	MH
MOL000492	(+)-catechin	54.83	0.24	-0.03	5	CS,MH,GZ
MOL002823	Herbacetin	36.07	0.27	0.12	5	MH
MOL002881	Diosmetin	31.14	0.27	0.46	5	MH,QH
MOL003608	O-Acetylcolumbianetin	60.04	0.26	0.78	5	DH
MOL006992	(2R,3R)-4-methoxyl-distylin	59.98	0.3	0.17	5	CS

　　2.4 核心靶点互作图

　　将91个共同靶基因导入String数据库中，获得相互作用图，见图3，图中圆形节点表示每个基因蛋白，节点之间的直线代表该直线连接的2个蛋白有相互作用关系，线越粗代表作用关系越强。节点颜色代表不同证据的交互类型，根据不同来源的证据计算score，颜色由红变紫映射score由大变小。然后按照节点（degree）的多少，得到互作关系排名前30的靶点，平均节点数为13.3个，见图4。barplot图显示，早期原癌基因（JUN），丝裂原活化蛋白激酶1（MAPK1），丝氨酸蛋白激酶1（AKT1），白介素-6（IL6），丝裂原活化蛋白激酶14（MAPK14），表皮生长因子受体（EGFR），热休克蛋白90AA1（HSP90AA1），信号传导及转录激活因子1（STAT），酪氨酸蛋白激酶JAK1（JAK1），重组人有丝分裂原激活蛋白激酶8（MAKP8）,血管内皮生长因子A（VEGFA）、雌激素受体1(ESR1）、原癌基因c-fos（FOS）、白介素-1β（IL1β)、白介素4（IL4）、白介素2（IL2）、酪氨酸蛋白激酶JAK1（JAK2）等基因排名靠前，这些度值较大的节点在整个网络中起着关键的作用，可能是温阳通络方治疗RA的关键靶点，其基本信息见图4。

　　图3温阳通络方靶点蛋白互作网络  

　　Fig.3 PPI network of Wenyang Tongluo Prescription

　　图4 PPI中的核心基因   

　　Fig.4 Core genes in PPI

　　2.5 GO功能富集分析与KEGG通路富集分析

　　使用R软件91个共同靶点进行GO功能富集分析，其中生物学过程1766条，分子功能101条，细胞组成27条，筛选出排名前20的分子功能，其中预测靶点在生物过程中对脂多糖的调节(response to lipopolysaccharide)、对细菌起源的分子的反应(response to molecule of bacterial origin)、抗氧化反应(response to oxidative stress)列前三位；在细胞组分中细胞膜膜筏(membrane raft)、膜微区(membrane microdomain)、膜区(membrane region)、黏着斑(focal adhesion)、细胞基质黏着小带(cell−substrate adherens junction)和细胞-基质结(cell−substrate junction)比例最大；而在分子功能中与细胞因子受体结合(cytokine receptor binding)和细胞因子活性(cytokine activity)关系最密切,具体结果见图5a/5b/5c。

　　图5a GO通路富集分析的BP分析气泡图(前20)   

　　Fig.5a BP analysis of GO pathway enrichment analysis buble (top 20)

　　图5b GO通路富集分析的CC分析气泡图(前20)   

　　Fig.5b CC analysis of GO pathway enrichment analysis bubble (top 20)

　　图5c GO通路富集分析的MF分析气泡图(前20)   

　　Fig.5c MF analysis of GO pathway enrichment analysis bubble(top 20)

　　注：图形左侧字母为GO名称，下面数字为基因的比例，圆圈大小表示富集的基因的数目，颜色代表P值，颜色越红，富集的程度越高，相应的P值越小。

　　通过KEGG分析结果显示共有131条KEGG代谢通路参与其中,筛选出富集基因数较多的前20条通路,主要涉及AGERAGE信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、肿瘤坏死因子信号通路(TNF signaling pathway)、流体剪切应力和动脉粥样硬化(Fluid shear stress and atherosclerosis)、IL-17信号通路(IL−17 signaling pathway)、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染(Kaposi sarcoma−associated herpesvirus infection)、Th17细胞分化(Th17 cell differentiation)等。涉及炎症反应、细胞凋亡与免疫调节等多个环节,提示温阳通络方通过调节多种代谢通路共同发挥治疗RA的作用。

　　图6 KEGG通路富集分析柱状图(前20)   

　　Fig.6 KEGG pathway enrichment analysis barplot (top 20)

　　注：图形左侧为pathway名称，下面数字为富集在KEGG上的基因数目，柱状图形表示富集在KEGG上的基因，P代表富集的显著性，颜色越红，富集的程度越高，相应的P值越小。

　　2.6 靶点-作用通路网络构建

　　将靶点-通路关系文件导入Cytoscape 3.7.2软件,选取排名前20的KEGG代谢通路，构建温阳通络方治疗RA靶点-作用通路网络,见图7，从图中可见温阳通络方中预测通过作用于66个作用靶点,通过排名前20的作用通路,，其中JUN、FOS、MAPK1/8/14、IL6/1β/1α/2/4、MTOR等在各通路中富集次数比较多，具体见表2。

　　图7 靶点-信号通路网络

　　Fig.7 target-pathway network

　　注：图中黄色代表基因，红色代表通路，图形越大，说明该节点degree值越大。

　　表2  KEGG通路分析结果(前20） 

　　Table 2 KEGG pathway analysis results (top 20)

编号	通路名称	基因数	P值
hsa04933	AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications	25	2.15×10-28
hsa04668	TNF signaling pathway	22	1.81×10-22
hsa05418	Fluid shear stress and atherosclerosis	23	1.12×10-21
hsa04657	IL-17 signaling pathway	20	3.39×10-21
hsa05167	Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection	23	1.05×10-18
hsa04659	Th17 cell differentiation	18	3.50×10-17
hsa05161	Hepatitis B	20	2.72×10-16
hsa05140	Leishmaniasis	15	1.90×10-15
hsa05142	Chagas disease (American trypanosomiasis)	16	7.50×10-15
hsa05145	Toxoplasmosis	16	3.46×10-14
hsa05162	Measles	17	6.32×10-15
hsa04620	Toll-like receptor signaling pathway	15	2.04×10-13
hsa04926	Relaxin signaling pathway	16	3.36×10-13
hsa05235	PD-L1 expression and PD-1 checkpoint pathway in cancer	14	4.03×10-13
hsa04066	HIF-1 signaling pathway	15	4.16×10-13
hsa05215	Prostate cancer	14	1.38×10-12
hsa01522	Endocrine resistance	14	1.59×10-12
hsa05164	Influenza A	17	2.05×10-12
hsa05210	Colorectal cancer	13	5.05×10-12
hsa05152	Tuberculosis	17	5.21×10-12

　　3 讨论

　　温阳通络方具有温经散寒、祛风除湿、通络止痛之功，主治风寒湿痹型RA。该方治疗RA的临床疗效已被广泛认可，具有良好的抗炎作用、免疫抑制功效及良好的安全性，但具体机制不甚明确。有研究发现，其对RA的治疗作用可能通过干预Th17分化所需的关键细胞因子及转录因子的表达,抑制IL-17A等促炎因子的分化而降低其高致病性,阻止CD4+T细胞向高致病性Th17细胞分化,同时通过减少IL-6的表达,上调具有免疫抑制功能Treg细胞的表达等方面, 从而阻止或延缓了RA的发展与转归[11-13]。以往的研究为本文提供了线索及基础，但尚不全面,随着系统生物学的推广，基于大数据的网络药理学已成为分析复杂成分的中药方剂作用机制的重要方法。

　　通过网络药理学研究发现，温阳通络方的活性成分119个化合物，可在体内作用于383个靶点，进一步分析发现，在排名靠前7的活性成分中，有5个均属于黄酮类化合物，包括槲皮素、藤黄菌素、山柰酚、黄芩素、柚皮素，黄酮类化合物是最丰富的酚类，在抗黄嘌呤氧化酶活性、免疫调节[14]等方面均具有显著效果，分而言之，槲皮素作为作用靶点(61个)最多的化合物，可显著抑制关节炎症反应，通过抑制NF-κB的生物活性，减少Th17分化及IL-1β、IL-17、TNF-α的蛋白表达，减轻氧化应激反应、抑制滑膜细胞的异常增殖与环氧合酶活性等，从而起到消炎镇痛、抑制骨损伤的效果具有[15-16]；山柰酚能抑制RA成纤维细胞、滑膜细胞的迁移和侵袭，阻断MAPK通路的激活[17]；黄芩素能抑制IL-1β诱导的RAFLS增殖、NF-κB转录活性和MIF介导的信号传导[18]；柚皮素能降低抗凝血酶、T细胞增殖，抑制MAPK和NF-κB信号传导[19]。另外，β-谷甾醇能抑制IL-6、INFγ和VEGF表达的作用[20]，具有类激素样作用，可以调节下丘脑-垂体-肾上腺素轴系统而起到类似于氢化可的松的抗炎作用[21]，而去氧乌头碱则具有显著的镇痛抗炎活性[22]。以上核心成分可能作为温阳通络方治疗RA的主要药效群。

　　通过对交集基因进行蛋白-蛋白互作分析发现，JUN、MAPK1、AKT1、IL6、MAPK14、EGFR、HSP90AA1、STAT、JAK1、MAKP8、VEGFA、ESR1、FOS、IL1β、IL4、IL2、JAK2为核心基因。c-fos和c-jun是原癌基因，在受到神经递质、激素或疼痛等刺激时，能立即被启动复制并转录表达, 最终分别转录为FOS基因和JUN基因，参与各效应酶信号传递系统的转录过程,调控其他多种基因的靶蛋白合成,从而影响细胞的增殖和分化故PPI分析中与其他基因联系较为密切，c-fos蛋白对疼痛及炎症非常敏感[23]，c-jun氨基末端激酶(c-JUN N-terminal kinase,JNK) 也常为炎症药物治疗的靶点[24]；MAPK基因参与的信号通路可减少氧自由基，抑制细胞增殖并促凋亡，减少炎症反应，同时减轻HIF-1α介导的血管生成，从而有效延缓RA进展[25]；白介素家族是一类最庞大、最重要的细胞因子，在机体内免疫调节中发挥着重要的作用，大量研究表明炎症相关的细胞因子及趋化因子在RA的发病过程中发挥重要作用，IL-6是RA病程中主要的炎症介质，其主要致病作用包括促进炎症相关的B细胞和Th17细胞的分化以及急性期蛋白的合成，此外与IL-1共同诱导基质金属蛋白酶(MMPs)的产生,破坏关节软骨等[26]。ESR基因可以调节免疫反应及炎性细胞因子表达，参与多种自身免疫性疾病[27]；VEGF基因与KDR基因参与血管新生及NF-κB信号通路，调控滑膜细胞增殖凋亡，及血管翳形成[28]；在GO功能富集生物过程中，对脂多糖的调节、对细菌起源的分子的反应、抗氧化反应列前三位，细菌脂多糖作为革兰阴性菌的重要致病因子, 能引起多种炎症反应，故在温阳通络方治疗RA可能是作用于以上交集基因，从而抑制炎性反应、抗氧化反应等多种生物学功能来起到治疗效果。

　　在KEGG通路富集结果中，其通路包括AGERAGE信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化、IL-17信号通路、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、Th17细胞分化等。其中Th17细胞分化，IL-17信号通路为蠲痹颗粒治疗RA关键通路，与前期实验研究相互印证。AGERAGE信号通路通过引起氧化应激反应与激活NF-κB[29]，诱发一系列炎症级联反应，破坏髓鞘、细胞骨架等蛋白[30]，骨细胞能感应液体流动产生的剪切应力而产生破骨和成骨的信号，并通过树突将信号传递给骨表面的成骨细胞和破骨细胞，从而调节骨骼重建[31]，而流体剪切应力又间接导致动脉粥样硬化，使关节局部淤阻。目前，关于卡波西肉瘤相关疱疹病毒与RA之间的关系研究较少，在免疫缺陷或失调的情况下, 如Th1类细胞因子的作用下，潜伏的病毒会被被激活，参与多种细胞周期蛋白、细胞凋亡分子、细胞因子表达的调控[32]，考虑其可能是通过改变自身免疫、炎症反应等对RA造成影响，可以此为扩展温阳通络方的适应范围提供思路，开展进一步研究。

　　综上所述，温阳通络方中主要通过槲皮素、藤黄菌素、山柰酚等活性成分，抑制炎症及自身免疫疾病相关的JUN、MAPK1、AKT1、IL6、MAPK14等众多靶点，影响细胞因子受体和活性、炎性反应、抗氧化反应等多种生物学功能，进而抑制炎症反应、调节免疫功能及调控细胞凋亡等多条通路来治疗RA。结合前期的研究成果可以部分地验证本研究预测结果的正确性，也为进一步机制研究和扩大临床适应范围指出了较可靠的研究方向。但数据库中纳入的信息有一定的局限性,结果往往偏向于对热点问题的研究,且中药复方剂量在临床应用过程中往往是随症加减。因此，温阳通络方对治疗RA的作用机制还需待进一步实验验证。

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