基于“以方测证”探讨云南春燥环境对小鼠气道IgG、SIgA、SP-A、SP-D的影响

林银骥　 陈楚珺　宋志敏　杨梅

（云南中医药大学）

（本论文荣获“第六届兰茂论坛”优秀论文三等奖）

　　摘要  目的：初步探讨云南春燥环境对小鼠气道免疫球蛋白G（IgG）、分泌型免疫球蛋白A（SIgA）、表面活性蛋白A（SP-A）、表面活性蛋白D（SP-D）的影响，以期为云南春燥动物模型的研制提供客观指标。方法：模拟云南春燥环境因素施加于实验小鼠，以桑杏汤、沙参麦冬汤及桑杏汤加沙参麦冬汤合方进行药物干预，于第15天检测指标。结果：与正常组比较，小鼠气道IgG含量上升，（P>0.05），SIgA、SP-A、SP-D含量均显著上升（P<0.01）。结论：治燥方剂干预下，各组实验小鼠指标均有所改善，其中SIgA、SP-A、SP-D指标变化具有统计学意义，可作为该模型的客观检测指标。

　　关键词  春燥；桑杏汤；沙参麦冬汤；气道免疫功能

　　燥属六气，其性干涩，清肃收敛。燥气太过，伤人致病，是为燥邪。“一交秋分,燥金司令…人身应之,燥病生焉。凡有身热咳嗽、内烦口干一切百病,无不起于干燥。”(《医学传灯·卷上》。喻嘉言[[[] 清·喻昌.医门法律[M].北京:中国中医药出版社,2002:204.]]有言：“秋月天气肃而燥胜，斯草木黄落。故春分以后之湿，秋分以后之燥，各司其政。”（《医门法律·秋燥论》）提出秋燥病名，初起多伤肺卫，常见津液疏部失司之干燥症状，治以辛凉甘润。然地域有别，气候存异。石芾南之《医原》曰：“如久旱则燥气生，干热、干冷则燥气亦胜”、“在春为风燥，在夏为暑燥，在秋为凉燥，在冬为寒燥。”云南地域、气候环境更易使居于此地人群于春季感燥而出现口鼻、肌肤干燥，干咳少痰之燥证。郑进教授[[[] 郑进,罗艳秋,等.云南春燥概念的提出及其临床辨治[J].中华中医药学刊,2009,27（5）:923-925.]]首次将“发生于滇中、滇西北、滇东北为代表的云南地区，以感受燥邪为主要病因，以口鼻、咽喉、肌肤干燥和干咳等各种症状为特征的一组中医证候”定义为“云南春燥”。目前关于云南春燥的研究已从文献研究、临床研究进入到实验研究初起阶段[[[] 杨梅,王雪梅，郭晟,等.基于数据挖掘的云南燥证证候规律研究[J]. 中华中医药学刊,2013(10):2162-2165.]]。在模拟云南地区干燥多风气候特点以及云南民俗喜食辛辣口味基础上，进行春燥模型探索，并以治燥经典方进行干预，观察相关指标变化，拟为春燥动物模型的建立确立客观指标。

　　1材料与方法

　　1.1实验药物

　　桑杏汤: 桑叶9g、苦杏仁10g、沙参9g、象贝10g、香豉10g、栀皮10g、梨皮12g。沙参麦冬汤：沙参9g、玉竹12g、生甘草9g、冬桑叶9g、麦冬12g、生扁豆10g、花粉10g（《温病条辨》）。药材由云南省中医医院提供，经鉴定悉为正品。制备药物，取10倍水浸泡药材30min，煮沸30min，滤过；药渣加8倍量水继续煎煮，再次煮沸30min，滤过；最后，药渣再加8倍量水第三次煮沸30min，滤过。合并三次滤液，水浴浓缩至实验所需药液浓度，4℃保存备用。按人和动物体表面积计算法，根据临床药效剂量，换算出小鼠等效剂量，桑杏汤为9.1g/kg，沙参麦冬汤为9.23g/kg，合方汤药为9.165g/kg。小鼠的灌胃给药体积设为10ml/kg。

　　1.2实验动物

　　SPF级昆明种小鼠60只，均为雄性，体重（20±2）g/只。由昆明医科大学实验动物中心进行提供，实验动物生产许可证号：SCXK（滇）K2015-0002。云南中医学院动物房提供场地进行饲养。

　　1.3实验试剂与仪器

　　SIgA ELISA试剂盒（江苏卡尔文生物科技有限公司，批号：20171018A）；IgG ELISA试剂盒（江苏卡尔文生物科技有限公司，批号：20171018B）；SP-A ELISA试剂盒             （江苏卡尔文生物科技有限公司，批号：20171018C）；SP-D ELISA试剂盒                （江苏卡尔文生物科技有限公司，批号：20171018D），其余试剂均为分析纯。动物培养箱RGX-250 （上海印溪仪器仪表有限公司），超声波加湿器（中山市哥尔电器有限公司），离心机（国产湘仪CTK150R），恒温水浴锅（江苏海门）。

　　1.4方法

　　1.4.1分组  实验小鼠于动物房适应性喂养3日后，采用随机法将60只小鼠分为正常组、模型组、阴性组、桑杏汤组、沙参麦冬汤组、合方组，共6组，每组10只。

　　1.4.2施加因素及给药  6组均置于人工气候动物培养箱内饲养。正常组设置温度（20±2）℃，相对湿度（60±2）%，饲喂普通饲料，期间不限制饮食饮水，不施加任何因素。其余5组设置温度（23±2）℃，相对湿度（31.5±2）%，以香燥饲料喂养，期间不限制饮食饮水。每日8时—20时，给予吹风干预，调节风速2.7m/s。6组小鼠每日8时—20时提供正常光照。施加因素第一天起分别对实验动物予以药物及水灌胃，阴性组小鼠每日灌以白开水，桑杏汤组小鼠每日灌以桑杏汤药物，沙参麦冬汤组小鼠每日灌以沙参麦冬汤药物，合方组小鼠每日灌以桑杏汤加沙参麦冬汤合方药物。

　　1.4.3指标检测  小鼠气道IgG、SIgA、SP-A、SP-D含量均用ELISA法[[[] 汪谦,主编.现代医学实验方法.北京:人民卫生出版社,1998:738]]检测。每组实验小鼠进行施加因素干预14天，于第15天进行动物组织取材处理。实验小鼠取材前12小时禁食禁水。常规颈椎脱臼处死，暴露气管部分，从喉头处进行常规气管插管，缓慢推注提前预温37℃无菌生理盐水1ml进入肺组织，回抽此液，重复2次灌洗，离心取上清液（离心机设置20min，2500r/min），获得样品标本备检。

　　1.5统计分析方法

　　实验数据采用SPSS22.0软件进行分析，数据用均值±标准差(±S)表示。组间比较，采用单因素方差分析方法(One-Way ANOVA)进行统计数据的处理，如符合正态分布和方差齐，两两比较则采用LSD检验；如若方差不齐则进行 Tamhane’s 方法进行检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

　　2结果

　　春燥环境对小鼠气道IgG、SIgA、SP-A、SP-D的影响与正常组相比较，模型组IgG含量上升，但差异无统计学意义（P>0.05），sIgA、SP-A、SP-D含量显著上升（P<0.01）。

　　与模型组相比，阴性组与桑杏汤组小鼠气道sIgA含量极显著下降（P<0.001）；沙参麦冬汤组与合方组小鼠气道sIgA含量下降，差异具有统计学意义（P<0.05）。阴性组与合方组小鼠气道SP-A含量下降，但无统计学意义（P>0.05）；桑杏汤组SP-A含量下降，差异具有统计学意义（P<0.05）。阴性组、沙参麦冬汤组与合方组小鼠气道SP-D含量均下降，但差异无统计学意义（P>0.05）；桑杏汤组SP-D含量下降（P<0.05）。见下表。

组别	数量	IgG（mg/mL）	SIgA (ug/mL)	SP-A (pg/mL)	SP-D (pg/mL)
正常组	10	15.62±1.70	20.64±2.27	17.94±4.09	26.10±4.87
模型组	10	17.53±0.90	24.20±1.93**	23.08±3.59**	31.30±4.02**
阴性组	10	15.99±1.08	19.57±3.04###	22.17±2.96	28.50±3.62
桑杏汤组	10	15.51±0.72	18.63±3.60###	19.06±4.28#	27.12±2.68#
沙参麦冬汤组	10	15.57±0.98	21.80±2.07#	27.54±3.66#	31.21±1.93
合方组	10	15.39±1.14	21.45±1.86#	19.37±5.86	28.48±3.96

 

　　云南春燥环境对小鼠气道IgG、SIgA、SP-A、SP-D的影响（±S）

　　注：与正常组相比较，**P<0.01；与模型组相比较，###P<0.001，#P<0.05。

　　3讨论

　　3.1燥伤津液，燥胜则干

　　研究六淫邪气病因病机的重要方法之一，是运用现代医学实验手段，结合现代气象学，选择一个较小时间段进行气候模拟与重现[[[] 苏颖,李霞,张焱,等.中医运气学说与现代气象学理论研究.长春中医学院学报,2003;19(6):49]]。本实验根据云南气象局所提供的近20年的当地气候条件，结合前期实验研究，云南地区人们喜食辛辣香燥的饮食特点，以人工气候箱进行设置模拟。所得结果显示，春燥环境下小鼠可见焦虑、多动等行为，打斗迹象明显，饮水量增加，爪甲枯槁，尿少色黄。由于春季肝气旺盛，燥热之邪助长阳气，易致肝阳上亢，故见焦虑、多动及打斗之征；饮水量及二便情况是判断小鼠体内津液盈亏的重要体征，由于燥伤津液，故见饮水量增加，尿少色黄；张从正言：“燥于外则皮肤皱揭，燥于中则精血枯涸，燥于上则咽鼻焦干，燥于下则便秘结闭”。燥邪犯肺，宣肃失司，伤津耗液，不达表皮、四末，遂可见爪甲枯槁，皮毛无泽。小鼠的一系列表征反映出春燥环境影响了小鼠的生理功能，燥邪致其体内津液受损，肺卫失宣。

　　3.2燥邪犯肺，肺卫失宣

　　中医理论认为，外邪犯表，肺即宣发卫气外出，抵御外邪、保卫人体，发挥卫外功能。有学者研究发现[[[]廖世忠,陆社桂.玉屏风散防治易感者探讨其“卫气”与免疫球蛋白的关系[J].辽宁中医杂志,1993,(11):18-19.]][[[]王方勇,陈政良.SP-A、SP-D与肺部天然免疫防御[J].免疫学杂志,2002,18(3):75-77.]]， SIgA、IgG、SP-A、SP-D在呼吸系统免疫防御方面发挥着重要的作用，与中医的肺气卫外功能有着密切的相关性，人体卫外功能与现代免疫有许多相似之处。SIgA主要存在于上呼吸道并反映其相关病变，气道液合成分泌SIgA，以吞噬外来病菌，激发免疫应答。因此，SIgA上升，在一定程度上提示有外来病菌侵入气道，气道免疫功能作出反应。同理，SP-A、SP-D的大量合成分泌，亦是扶正抗邪，保护气道组织，固护机体，防御外邪入侵的行为。这与中医卫外功能有异曲同工之意。本实验选择SIgA、IgG、SP-A、SP-D等指标，旨在从微观层面客观判断风燥邪气是否对小鼠卫外功能产生影响？并在此基础上运用以方测证的方法，筛选能够反映小鼠卫外功能正常与否的客观检测指标。

　　本实验结果显示，与正常组相比，模型组小鼠气道SIgA、SP-A、SP-D含量明显上升，而与模型组相比，阴性组、桑杏汤组、沙参麦冬汤组以及合方组均提示机体SIgA分泌减少，其中桑杏汤组SIgA、SP-A、SP-D含量均明显下降，其余三组小鼠气道SP-A、SP-D含量虽有减少，但效果不明显。实验结果说明，小鼠出现了免疫应答反应，提示小鼠在所居环境下遭受到邪气入侵，结合小鼠外在表征初步判断为风燥之邪入侵，正气奋起抗邪，故而小鼠出现免疫应答。然而，在饮水及药物干预下，津液得以补偿，燥症得到缓解。

　　桑杏汤组小鼠气道SIgA、SP-A、SP-D含量均下降明显，说明桑杏汤对该小鼠模型的治疗效果优于沙参麦冬汤与合方，能够滋养肺津，促进卫气宣发。桑杏汤是治外燥之典型方，据郑进教授[[[]郑进,罗艳秋,等.云南春燥概念的提出及其临床辨治[J].中华中医药学刊,2009,27（5）:923-925.]]所指，春燥多兼风，具有风燥邪气相互承袭兼化的特点，外燥多于内燥。而桑杏汤清肺润燥的同时，桑叶、淡豆豉等更发挥其疏散风热，祛除风邪之功。以桑杏汤方测春燥证，方证契合紧密，故实验结果明显，也提示本组实验小鼠偏于外燥模型。

　　IgG是下呼吸道的免疫球蛋白，其主要存在于终末细支气管以下的气道中，一般反映下呼吸道的病变。本实验研究中与正常组相比，模型组小鼠气道IgG含量上升不明显。考虑燥邪自口鼻而入，侵犯肺卫，病位居上、较浅，邪气对下呼吸道损伤小，同时也可能存在样本质量、实验过程中操作不够严谨等问题，故机体未作出明显反应。IgG是否适合作为云南春燥模型的客观检测指标，有待于进一步斟酌。

　　总之，本实验结果提示风燥邪气侵袭小鼠，燥伤津液，燥胜则干，故而小鼠表现出一系列干燥症状。又由于燥邪首先犯肺，肺失宣降，卫气受遏，邪正交争。表现出小鼠气道SIgA、SP-A、SP-D含量有所升高，以方测证中在桑杏汤、沙参麦冬汤及二者合方干预下又有所改善，初步认为云南春燥环境偏于外燥，且对小鼠生理功能产生较为显著的影响，测定SIgA、SP-A、SP-D含量可作为云南春燥证候模型客观检测指标。

　　参考文献

　　[1] 清·喻昌.医门法律[M].北京:中国中医药出版社,2002:204.

　　[2] 郑进,罗艳秋,等.云南春燥概念的提出及其临床辨治[J].中华中医药学刊,2009,27（5）:923-925.

　　[3] 杨梅,王雪梅，郭晟,等.基于数据挖掘的云南燥证证候规律研究[J]. 中华中医药学刊,2013(10):2162-2165.

　　[4] 汪谦,主编.现代医学实验方法.北京:人民卫生出版社,1998:738

　　[5] 苏颖,李霞,张焱,等.中医运气学说与现代气象学理论研究.长春中医学院学报,2003;19(6):49

　　[6]廖世忠,陆社桂.玉屏风散防治易感者探讨其“卫气”与免疫球蛋白的关系[J].辽宁中医杂志,1993,(11):18-19.

　　[7]王方勇,陈政良.SP-A、SP-D与肺部天然免疫防御[J].免疫学杂志,2002,18(3):75-77.

 

　　[8]郑进,罗艳秋,等.云南春燥概念的提出及其临床辨治[J].中华中医药学刊,2009,27（5）:923-925.