吴晶金 李兆福 李玲玉 粟荣 殷世云
(云南省中医医院风湿科)
(本论文荣获“第四届兰茂论坛”优秀论文三等奖)
摘要 目的：探讨益肾养阴合剂对自发性系统性红斑狼疮模型鼠氧化应激损伤的影响。方法：将30只MRL/lpr小鼠随机分为6组(每组5只)：模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、激素组、中药配合激素组。用药4周后，心脏穿刺取血，4℃静置2h后2500rpm离心20分钟分离血清，以紫外分光光度法检测各组血清中SOD、CAT、MDA值;脱颈处死小鼠，取新鲜肾脏组织检测dsDNA浓度。结果：1.治疗4周后，益肾养阴合剂高剂量组、激素组、中药配合激素组SOD水平明显升高，具有显著差异(P<0.01)，益肾养阴合剂中剂量组与模型组比较SOD数值有统计学意义;2. 与模型组相比，益肾养阴合剂高剂量组、激素组、中药配合激素组CAT活性明显升高，具有显著差异(P<0.01)，益肾养阴合剂中剂量组、低剂量组与模型组比较CAT数值有统计学意义(P<0.05);3. 与模型组相比，益肾养阴合剂高剂量组、激素组、中药配合激素组MDA含量明显下降，具有显著差异(P<0.01)，益肾养阴合剂中剂量组与模型组比较MDA数值有统计学意义(P<0.05)。4. 与模型组相比，益肾养阴合剂高剂量组、激素组、中药配合激素组dsDNA水平明显降低，具有显著差异(P<0.01)，益肾养阴合剂中剂量组与模型组比较dsDNA数值有统计学意义(P<0.05)。结论：益肾养阴合剂可有效降低血清MDA、dsDNA水平，提高血清SOD、CAT活性。
关键词：益肾养阴合剂;系统性红斑狼疮;氧化应激损伤机制;
系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是自身免疫介导的，以免疫性炎症为突出表现的弥漫性结缔组织病[1]。血清中出现以抗核抗体为代表的多种自身抗体和多系统受累是SLE的两个主要临床特征。本病好发于生育年龄女性，多见于15～45岁年龄段，女：男为7～9：1。流行病学研究显示，我国患病率为 70/10 万，妇女中则高达113/10万人。SLE急性期病人的死亡原因主要是多脏器严重损害和感染。其5年存活率为90%，10年存活率为80%。SLE临床表现复杂多样，可累及多个重要脏器，甚者出现狼疮危象，危及生命。中医认为气阴两虚是系统性红斑狼疮发生的病理基础[2]。益肾养阴是治疗系统性红斑狼疮的重要手段，益肾养阴合剂主要由黄芪、太子参、麦冬、五味子、女贞子、旱莲草、丹参、白茅根等10余味中药组成。临床主要用于系统性红斑狼疮(气阴两虚型)的治疗。临床研究显示，益肾养阴合剂能明显改善SLE缓解期气阴两伤证的临床症状，降低ESR、CRP、ANA滴度等指标，总有效率达到96.67%[3]。氧化应激损伤在SLE致病作用中扮演重要作用。所有类型的细胞，包括淋巴细胞和免疫细胞，其氧化反应均由抗氧化酶复合物即超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)，过氧化氢酶(Catalase，CAT)，丙二醛(malondialdehyde, MDA)调节，并防止自由基介导的细胞毒作用。有研究报道，SLE患者的过氧化物和羟基等自由基产物显著增加，脂质过氧化作用指标亦显著升高[4-5]。脂质水平、过氧化水平的提高与疾病的严重程度和器官损伤有着极大的关联。氧应激可使损伤局部的吞噬细胞被激活，释放活性氧，活性氧渗透入细胞膜与DNA发生反应，构象改变的DNA作为抗原引起抗DNA抗体的产生[6]。本研究以SOD、CAT、MDA、dsDNA为切入点，拟通过自发性狼疮鼠模型，探讨益肾养阴合剂抗氧化应激损伤作用，为益肾养阴合剂治疗系统性红斑狼疮提供实验数据及理论依据。
1.材料与方法
1.1实验动物
自发性系统性红斑狼疮模型鼠(MRL/lpr小鼠)30只，7～8周龄，体重(20±2g),雄性，购自南京大学-南京生物医药研究院，动物许可证号SCXK(苏)：2010-0001。饲养于昆明医科大学实验室动物房。实验前适应性喂养1 周，自由摄食摄水，光暗循环。动物房温度维持在25 ℃，湿度维持在45%-55%之间。
1.2药物及试剂
益肾养阴合剂(由云南省中医医院中药房提供); SOD试剂盒、CAT紫外线试剂盒、MDA测试盒，南京建成生物工程研究所。Mouse dsDNA ELISA kit，欣博盛生物科技有限公司。醋酸泼尼松片( 重庆科瑞制药( 集团) 有限公司，批号: H50020459) 。
1.3实验方法
1.3.1益肾养阴合剂对各组MRL/lpr小鼠SOD、CAT、MDA的影响
将30只MRL/lpr小鼠随机分为6组(每组5只)：模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、激素组、中药配合激素组。模型组：给予等量生理盐水灌胃，10ml/Kg/d;高剂量组：益肾养阴合剂，60g/Kg/d;中剂量组：益肾养阴合剂，30g/Kg/d;低剂量组：益肾养阴合剂，15g/Kg/d;激素组：醋酸泼尼松混悬液5mg/Kg/d;中药配合激素组：益肾养阴合剂生药30g/Kg/d+醋酸泼尼松混悬液5mg/Kg/d。用药4周后，心脏穿刺取血，4℃静置2h后2500rpm离心20分钟分离血清，以紫外分光光度法检测各组血清中SOD、CAT、MDA的OD值，结合结果，参考说明书进行公式计算，并根据总蛋白浓度换算为对应单位蛋白。
1.3.2益肾养阴合剂对各组MRL/lpr小鼠dsDNA的影响
各组MRL/lpr小鼠肾脏组织，加入4℃的PBS在冰浴中进行匀浆，随后匀浆液4℃离心，取上清作为待测样品，用dsDNA检测试剂盒检测各孔浓度值。
1.4统计方法
采用SPSS 17.0 软件进行统计分析。计量资料以 均数±标准差( ±s )表示，组间数据比较采用方差分析(ANOVA);以P < 0.05为差异有统计学意义。
2.结果
2.1益肾养阴合剂对MRL/lpr小鼠SOD的影响
与模型组相比，益肾养阴合剂高剂量组、激素组、中药配合激素组SOD水平明显升高，具有显著差异(P<0.01)，益肾养阴合剂中剂量组与模型组比较SOD数值有统计学意义(P<0.05)。(表1)(图1)。
表1益肾养阴合剂对MRL/lpr模型SOD的影响
图1 益肾养阴合剂对MRL/lpr模型SOD的影响