循环康胶囊的质量标准研究

　　李浩成1,3，李兴富2，郭利群1,3,4，贾林虎2，黄燕1,3

　　（1.云南现代民族药工程技术研究中心，昆明，650217；2.昆明市药物依赖性康复研究中心，昆明，650301；3.国家中药现代化工程技术研究中心云南民族药分中心，昆明，650217；云南省科学技术院，昆明，650228）

　　摘要：目的：建立循环康胶囊的质量控制方法。方法：采用薄层色谱鉴别等方法对循环康胶囊中的主要成分进行定性、定量测定。采用HPLC对样品中阿魏酸进行含量测定。色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈—0.085%磷酸溶液（17：83）为流动相；检测波长为316 nm，进样量为10 μL。结果：薄层色谱中，供试品与对照品相应位置上出现相同颜色的斑点，阴性对照无干扰；高效液相色谱中，阿魏酸在0.00433 μg-0.03462 μg范围内线性关系良好，回归方程为Y=45942X-3.5808263，r=0.99996，理论板数平均为7294。平均回收率为99.15%。结论：薄层色谱法呈现斑点清晰、专属性强，可用于循环康胶囊的鉴别；高效液相色谱法简便快速、精密度高、准确度好，可用于胶囊的质量控制。

　　关键词：循环康胶囊；质量标准

　　Abstract: Objective: To establish a quality control method for Xunhuankang Capsules. Methods: TLC was used to identify the main components in Xunhuankang capsules. The content of ferulic acid in the sample was determined by HPLC. Chromatographic conditions: octadecylsilane bonded silica gel was used as filler; The mobile phase was acetonitrile-0.085% phosphoric acid (17:83); The detection wavelength was 316 nm and the injection volume was 10 μL。Results: In TLC, spots of the same color appeared on the corresponding positions of the test substance and the control substance, and the negative control had no interference. The linear range of ferulic acid in HPLC was 0.00433 μg-0.03462 μg. The regression equation was Y=45942X-3.5808263, r=0.99996, and the average theoretical plate number was 7294. The average recovery was 99.15%. Conclusion: TLC showed clear spots and strong specificity, which could be used for the identification of Xunhuankang Capsule. High performance liquid chromatography method is simple, rapid, high precision, good accuracy, can be used for the quality control of capsules.

　　Keywords: Xunhuankang；quality standard

　　循环康胶囊为民族民间中草药制剂，主要由三七、黄芪、丹参、茴心草等十三味药组成，具有活血化瘀，理气止痛的作用。用于冠心病及冠心病所引起的心绞痛，心肌梗塞，胸中憋闷，心悸；脑血栓形成和脑血栓恢复期的半身的半身不遂，偏瘫，口眼歪斜，语言不利。建立循环康胶囊的质量标准研究，有利于对药品质量的控制。为了保证循环康胶囊的产品质量，对其主要成分三七、黄芪、丹参、白芍采用TLC法进行定性鉴别，并用高效液相色谱法对当归中阿魏酸进行了定量测定考察。故建立循环康胶囊的质量标准进行研究具有十分重要的意义。

　　1.仪器、试剂与样品

　　1.1仪器及试剂

　　HP-1100液相色谱仪，Alltech C18色谱柱(250×4.6mm)，HP-1100系列的的单元泵，VWD可变波长检测器，手动进样器（美国安捷伦公司）。WFH-203型紫外可见分光光度计 （北京普析通用仪器有限责任公司）。

　　1.2试药

　　阿魏酸对照品（供鉴别和含量测定用），批号：1512-6210（中国药品生物制品检定所）；丹参酮ⅡA对照品，批号：150952—201503（中国药品生物制品检定所），人参皂苷Rb1对照品，批号：150745—201512；人参皂苷Rg1对照品，批号：150745—201541；三七皂苷R1对照品，批号：160745—201633；（中国药品生物制品检定所）；黄芪甲苷对照品，批号：1581—201510（中国药品生物制品检定所）。硅胶G（青岛海洋化工厂）。所用试剂均为分析纯。流动相配制用色谱纯。

　　1.3 样品

　　循环康胶囊，批号为20160201、20160202、20160203，由昆明康奇堂制药有限公司提供。

　　按照循环康胶囊工艺制备的缺三七的阴性样品；按照循环康胶囊工艺制备的缺丹参的阴性样品；按照循环康胶囊工艺制备的缺黄芪的阴性样品；按照循环康胶囊工艺制备的缺白芍的阴性样品。按照循环康胶囊工艺制备的缺当归的阴性样品。

　　2.薄层色谱法定性鉴别

　　2.1循环康胶囊中三七的鉴别

　　2.1.1对照品溶液的制备

　　取人参皂苷Rb1对照品、人参皂苷Rg1对照品及三七皂苷R1对照品,加甲醇制成每1 mL各含0.5 mg的混合溶液,作为对照品溶液。

　　2.1.2供试品溶液的制备

　　分别取三批循环康胶囊内容物0.5 g,加水5滴，搅匀，再加以水饱和的正丁醇5 mL，密塞，振摇10 min，放置2 h，离心，取上清液，加3倍量以正丁醇饱和的水，摇匀，放置使分层（必要时离心），取正丁醇层，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。

　　2.1.3三七的阴性对照品溶液的制备

　　取缺三七的阴性样品，按2.1.2方法制成三七阴性对照品溶液。

　　2.1.4薄层鉴别

　　对照薄层色谱法（中国药典2015版四部）试验，分别吸取对照品溶液、三批样品供试品溶液、三七的阴性对照品溶液各1 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷—乙酸乙酯—甲醇—水（15:40:22:10）于10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。如图1所示，1、2、3为3批样品制备的供试品，4为人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1及三七皂苷R1的混合对照品，5为阴性对照品，色谱中，3批供试品在与混合对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性无此斑点；置紫外光灯（365nm）下检视，显相同的荧光斑点。阴性无此斑点。

图1 鉴别三七中人参皂苷Rb1对照品、人参皂苷Rg1、三七皂苷R1的薄层色谱图

　　2.2循环康胶囊中丹参的鉴别

　　2.2.1对照品溶液的制备

　　取丹参酮ⅡA对照品，加甲醇制成2 mg·mL-1的溶液，作为对照品溶液。

　　2.2.2供试品溶液的制备

　　分别取三批循环康胶囊内容物2 g，加乙醚5 mL，振摇，放置1 h，滤过，滤液挥干，残渣加乙酸乙酯1 mL使溶解，作为供试品溶液。

　　2.2.3 丹参的阴性对照溶液的制备

　　取缺丹参的阴性样品，按2.2.2方法制成丹参的阴性对照溶液。

　　2.2.4薄层鉴别

　　对照薄层色谱法（中国药典2015版四部）试验，分别吸取对照品溶液、3批样品供试品溶液、丹参的阴性对照品溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（4:1）为展开剂，展开，取出，晾干。由图2所示，1、2、3为三批样品制备的供试品，4、5为丹参酮ⅡA的对照品，6为丹参的阴性对照品，色谱中，3批供试品在与丹参酮ⅡA对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；在与丹参的阴性对照品色谱相应的位置上，显相同的暗红色斑点。

　　日光

　　图2 鉴别丹参中丹参酮ⅡA的薄层色谱图

　　2.3循环康胶囊中黄芪的鉴别

　　2.3.1对照品溶液的制备

　　取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成1 mg·mL-1的溶液，作为对照品溶液。

　　2.3.2供试品溶液的制备

　　取循环康胶囊内容物3 g，加乙醇20 ml，加热回流1 h，滤过，滤液加于中性氧化铝柱（100～120目，5 g，内径10～15 mm）上，用40%甲醇100 mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加水30 mL使溶解，用水饱和正丁醇振摇提取2次，每次20 mL，合并正丁醇液，用水洗涤2次，每次20 mL，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇0.5 mL使溶解，作为供试品溶液。

　　2.3.3黄芪的阴性对照溶液的制备

　　取缺黄芪的阴性样品，按2.3.2方法制成黄芪阴性对照溶液。

　　2.3.3薄层鉴别

　　照薄层色谱法（中国药典2015版四部）试验，分别吸取对照品溶液、三批样品供试品溶液、黄芪的阴性对照品溶液各2 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷—甲醇—水（13:7:2）的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。如图3所示，1、2、3为3批样品制备的供试品，4为黄芪甲苷的对照品，5为黄芪的阴性对照品，色谱中，3批供试品在与对照品色谱相应的位置上，日光下显相同的棕褐色斑点；紫外光灯（365 nm）下显相同的橙色荧光斑点,阴性无此斑点。

图3 鉴别黄芪中黄芪甲苷的薄层色谱图

　　2.4鉴别白芍中芍药苷的薄层色谱研究

　　2.4.1对照品溶液的制备

　　精密称取芍药苷对照品0.5 g，加乙醇制成每1mg·mL-1的溶液，作为对照品溶液。

　　2.4.2供试品溶液的制备

　　取循环康胶囊内容物3 g，加乙醇20 ml,振摇5 min，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。

　　2.4.3白芍的阴性对照溶液的制备

　　取缺白芍的隐形样品，按2.4.2方法制成白芍阴性对照溶液。

　　2.4.4薄层鉴别

　　照薄层色谱法（中国药典2015版四部）试验，分别吸取对照品溶液、三批样品供试品溶液、黄芪的阴性对照品溶液各各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷—乙酸乙酯—甲醇—甲酸（40:5:10:0.2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%的香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰。如图4所示，1为芍药苷的对照品，2、3、4为3批样品制备的供试品，5为白芍的阴性对照品，色谱中，3批供试品在与对照品色谱相应的位置上，日光下显相同的蓝紫色斑点，阴性无此斑点。

　　图4 鉴别白芍中芍药苷的薄层色谱图

　　3 样品中阿魏酸的含量测定

　　当归在循环康胶囊中的为臣药，是主要药物之一，其主要成分为阿魏酸，选择该药中主要成分阿魏酸进行含量测定，对控制循环康胶囊的质量有十分重要的意义。

　　3.1色谱条件与系统适应性试验

　　以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.085%磷酸溶液（17：83）为流动相；检测波长为316 nm；流速：1.0 mL·min-1.柱温35℃.理论板数按阿魏酸峰计算应不低于6000。流动相的选择见表1。

　　表1 流动相的选择

　　在此条件下将阿魏酸对照品溶液、循环康胶囊供试品溶液、同法制备的阿魏酸阴性对照品溶液分别注入高效液相色谱仪中，进行测定，得到色谱图，见图5、图6、图7。可见供试品与对照品溶液在相应的位置上有相似的峰，而阴性对照在相应位置上无明显其它峰出现。

　　图5 阿魏酸对照品溶液

　　图6 循环康胶囊供试品溶液

　　图7 循环康胶囊阴性对照品溶液

　　3.2对照品溶液的制备

　　精密称取阿魏酸对照品2.000 mg，用甲醇定容制成0.02 mg·mL-1溶液，即得。

　　3.3供试品溶液的制备

　　取循环康胶囊(批号为20160201)内容物5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加0.5%碳酸钠溶液 80 mL，密塞，超声处理（功率100 W，频率55 KHz）30 min，提取液移至离心管中，离心（转速：4000r·min-1）10 min，取上清液，置分液漏斗中，沉淀再用0.5%碳酸钠溶液洗涤3次，每次20ml，洗涤液并入同一分液漏斗中，用2%氯化钠溶液饱和的乙醚洗涤3次，每次40ml，弃去乙醚液液，水溶液用盐酸调节PH值至1～2，再用2%氯化钠溶液饱和的乙醚振摇提取4次（40ml、40ml、35ml、35ml）,必要时离心消除乳化层，合并乙醚提取液，回收乙醚至干，残渣用甲醇溶解，转移至10ml棕色瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得（避光保存）。同法制得缺当归的阴性供试品溶液备用。

　　3.4线性关系考察

　　精密吸取对照品溶液(0.02164 mg·mL-1) 2、4、6、8、10、12、14、16μL进行色谱测定，按上述条件测定峰面积，结果见表2，以峰面积积分值对进样浓度进行回归处理，在0.00433 μg–0.03462 μg范围内呈现良好线性关系(见附图8)。回归方程为Y=45942X-3.5808263，r = 0.99996，理论板数平均为7294。

　　表2 线性关系考察结果

　　3.5精密度试验

　　取同一阿魏酸对照品溶液(0.02164 mg·mL-1)，按上述色谱条件，连续测定5次，结果如表3所示，测得峰面积积分值平均值RSD=0.73 %。试验结果表明：阿魏酸峰面积的相对标准差RSD<2%，说明仪器精密度良好。

　　表3精密度试验结果

　　3.6稳定性试验

　　取同一批样品（批号为20160201），按上述色谱条件测定6次，前四次间隔2 h，后两次为24 h后间隔2 h测定，每次进样量10μL，记录峰面积值。测得结果如表4。峰面积基本一致，RSD=1.05%(n=7)，表明溶液在24 h内稳定。

　　表4 稳定性试验结果

　　表5 重现性试验结果

　　精密取对照品溶液（0.02164 mg·mL-1）5mL、10mL、15mL（各双样），水浴蒸干，分别加入重现性试验的同一批号（批号为20160201）样品5.0g，精密称定，照含量测定方法测定，计算回收率，平均回收率，照含量测定方法测定，计算回收率，平均回收率为100.01%，RSD=0.66%，结果见表6，RSD＜2.0％，符合要求。

　　(回收率=实测量—样品含量)/对照品加入量＊100%

　　表6加样回收率试验结果

　　3.9样品的测定

　　分别取循环康胶囊十个批号的样品（昆明康奇堂制药有限公司提供，每粒0.4 g）,按含量测定方法进行测定，结果见表7。

　　表7样品的测定试验

　　4结论

　　用薄层色谱法鉴别制剂中的君药三七，臣药黄芪、丹参，佐药白芍，斑点清晰，阴性无干扰，因此具有专属性。

　　在定性实验中通过对臣药当归中主要成分阿魏酸检测的专属性试验，按照筛选所得的提取方法，配制供试品在阿魏酸的最大吸收波长316 nm下，空白对照在对照品相应吸收峰的位置无吸收，加样试验在其吸收峰位置仅出现一个相对面积增大的峰，可确定用该方法对其有效成分阿魏酸进行含量测定时，其他组分对检测结果无干扰，该方法对阿魏酸的检测有专属性，且提取分离方法较简便、稳定、准确，可有效控制该制剂的内在质量。

　　在对当归中阿魏酸的提取和检测过程中发现回流提取较超声提取含量更高，使用不同溶剂提取检测结果发现70%甲醇较100%甲醇提取含量更高。

　　鉴别中以黄芪的有效成分黄芪甲苷为对照品进行对照，由于本品为复方制剂，甲醇提取液的色谱背景较深，影响观察结果，因此将甲醇提取液分别用水饱和的正丁醇提取、通过D101型大孔吸附树脂柱、通过中性氧化铝柱进行层析，结果方法效果最好，供试品色谱中在与对照品色谱相应的位置上显一个相同的紫红色斑点，置紫外光灯(365 nm)下检视显相同的橙色荧光斑点。同时按照处方及制法制备的空白样品薄层色谱结果为阴性，说明此鉴别具有专属性。

　　参考文献：

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　　[2]苗明三,李振国编.现代实用中药质量控制技术. 人民卫生出版社.

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　　[4] 刘主编.中草药成分提取分离与制剂加工新技术新工艺新标准.中国教育出版社.

　　[5] 匡海学主编，中药化学.中国中医药出版社.

　　[6] 国家药典委员会编.中国药典中药质量标准研究制定技术要求.

　　[7] 云南省食品药品监督管理局编.云南省中药饮片标准.云南美术出版社.